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第一部分MicroRNA-200a在心脏纤维化的调控机制目的:心房颤动(房颤)是临床上常见的一种心律失常,显著增加发病率和死亡率,造成极大的社会经济负担。房颤的发病机制十分复杂,以纤维化为主要特征的心房结构重塑在促进复杂的折返的维持和房颤的持续方面起到关键作用。microRNAs属于一类小非编码RNA,参与一系列重要的生命进程和病理生理过程,近些年来,越来越多的研究显microRNAs在房颤的病理生理过程中发挥关键调节作用。近期研究显示microRNA-200a参与纤维化重塑过程中,但microRNA-200a在心脏纤维化中的具体作用机制尚不清楚。本研究的主要目的是通过采用体外细胞实验探究microRNA-200a在心肌纤维化中所发挥的作用,为了进一步研究microRNA-200a在房颤发生、发展和维持过程中产生影响的机制提供帮助。方法:采用microRNA目的基因预测工具预测到转化生长因子βⅡ型受体(transforming growth factor-β type 2,Tgfbr2)和内皮素 A 型受体(endothelin receptor type A,Ednra)是microRNA-200a的目的基因。向小鼠心肌成纤维细胞中加入血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,ANGⅡ)构建细胞纤维化模型,microRNA-200a的表达水平采用实时定量聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)测定。利用 LipofectamineTM RNAiMAX 将 microRNA-200a 模拟剂和抑制剂转染入细胞,用qRT-PCR和蛋白质免疫印迹(westernblot)测定心肌成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、TGFBR2和EDNRA的表达情况,并用细胞活性检测试剂盒(cellcounting kit-8,CCK-8)检测转染microRNA-200a模拟剂和抑制剂后细胞增殖情况。采用双荧光素酶报告基因实验对microRNA-200a与Tgbr2和Ednr的直接结合作用进行验证。结果:在采用ANGⅡ诱导小鼠心肌成纤维细胞构建的细胞纤维化模型中,microRNA-200a的表达水平显著降低。向小鼠心肌成纤维细胞内转染microRNA-200a模拟剂造成microRNA-200a过表达后,小鼠心肌成纤维细胞TGFBR2和EDNRA的表达显著降低,α-SMA及胶原的表达水平显著降低,而且细胞的增殖能力较对照组显著降低。与此相反,向小鼠心肌成纤维细胞内转染microRNA-200a抑制剂敲低microRNA-200a的表达水平后,小鼠心肌成纤维细胞TGFBR2和EDNRA的表达显著升高,α-SMA及胶原的表达水平显著升高,而且细胞的增殖能力较对照组显著升高。双荧光素酶报告基因实验进一步表明Tgfbr2和Ednra是microRNA-200a的靶基因。结论:在促纤维化因子诱导小鼠心肌成纤维细胞纤维化形成过程中,microRNA-200a的表达水平显著降低,解除microRNA-200a对其下游靶基因Tgfbr2和Ednra的抑制作用,促进小鼠心肌成纤维细胞的活化、增殖以及胶原蛋白的合成,进一步加重纤维化过程。microRNA-200a通过抑制Tgfbr2和Ednra减弱小鼠心肌成纤维细胞的增殖、活化及胶原蛋白合成,提示microRNA-200a在预防心脏纤维化上具有潜在治疗价值。第二部分血浆大内皮素-1对心房颤动患者预后的影响目的:心房颤动(房颤)是临床上常见的一种快速型心律失常,主要危害在于心动过速造成的心功能恶化和显著增加的脑卒中等血栓栓塞发生风险,建立新的危险因素以促进对房颤患者的预后评估和危险分层十分必要。内皮素-1作为心脏纤维化信号通路网络的重要组成部分,在房颤负性重塑中发挥重要作用。多项研究显示升高的内皮素-1水平是房颤发生的独立危险因素,然而探索内皮素-1水平与房颤患者长期预后关系的研究较少。本研究旨在评估内皮素-1水平对房颤患者长期预后的影响,以期将内皮素-1作为新的危险因素以促进对房颤患者的预后评估和危险分层。方法:本研究是一项单中心回顾性研究,旨在评价血浆大内皮素-1水平与房颤患者远期预后的关系。本研究共纳入716例自2009年至2015年连续就诊于医院并诊断为房颤的患者。通过查阅临床病例和电子数据库,搜集并记录患者的基线信息。血浆中大内皮素-1浓度的测定采用大内皮素-1 ELISA试剂盒(奥地利Biomedica公司)进行测量。采用电话、诊室或获取诊疗记录等方式对患者进行随访。本研究的主要终点事件定义为全因死亡和复合终点事件(定义为包括全因死亡、血栓栓塞和大出血在内的复合终点),次要终点事件定义为心血管死亡、血栓栓塞事件和大出血事件。依据受试者工作特征(receiver-operatingcharacteristic,ROC)曲线分析得到血浆大内皮素-1预测全因死亡的最佳界值,将研究对象分为大内皮素-1高水平组和大内皮素-1低水平组。计数资料的组间对比采用Person卡方检验或Fisher精确检验,计量资料的组间对比采用studentt检验或Mann-WhitneyU检验。采用Logistic回归分析识别与大内皮素-1高水平的相关因素。采用Kaplan-Meier方法描述患者的生存曲线,并采用对数秩检验进行组间对比。采用Cox回归模型评价血浆大内皮素-1水平与远期预后的关联,采用重分类改善指标(net reclassification improvement,NRI)分析和综合判别改善指数(integrated discrimination improvement,IDI)评估血浆大内皮素-1在预测房颤患者远期全因死亡和复合终点事件发生风险的增量贡献。结果:本研究人群的平均年龄为63.7±12.6岁,其中327名为女性。采用ROC曲线方法取得血浆大内皮素-1预测全因死亡的C统计量为0.772(P<0.001),最佳界值为0.55pmol/L。与大内皮素-l<0.55pmol/L组患者相比,大内皮素-1高水平组患者有显著更多的合并症和更差的心功能状态。Logistic回归分析显示较高的N-末端脑钠尿肽值、较低的左室射血分数以及增大的左房内径与大内皮素-1高水平独立相关。在中位时间为3年的随访期间内,共191例患者(7.8/100人年)发生死亡,237例患者(9.8/100人年)发生复合终点事件,143例患者(5.8/100人年)发生心血管死亡,66例患者(2.8/100人年)发生血栓栓塞事件,21例患者(0.9/100人年)发生大出血。与大内皮素-1低水平组相比,大内皮素-1高水平组全因死亡(12.5/100人年比3.5/100人年,P<0.001)和复合终点事件(14.8/100人年比5.3/100人年,P<0.001)的发生风险显著更高。对于次要终点事件,大内皮素-1高水平组较大内皮素-1低水平组心血管死亡(14.8/100人年比5.3/100人年,P<0.001)和大出血(1.3/100人年比0.5/100人年,P=0.016)的发生风险显著更高,且有增加的血栓栓塞风险倾向(3.4/100人年比2.4/100人年,P=0.071)。采用多因素Cox回归分析对混杂因素校正后,大内皮素-1≥0.55pmol/L仍是全因死亡(HR=2.03,95%CI 1.42-2.92,P<0.001)、复合终点事件(HR=1.73,95%CI 1.27-2.36,P=0.001)以及心血管死亡(HR=2.32,95%CI 1.48-3.64,P<0.001)的预测因素。进一步的NRI分析显示将大内皮素-1 ≥ 0.55 pmol/L加入由多因素Cox回归模型识别的预测全因死亡和复合终点事件发生风险的其他因素构成的预测模型中,可显著提高模型对全因死亡和复合终点事件的预测能力,分别提高0.32(95%CI 0.18-0.40,P<0.001)和 0.32(95%CI0.16-0.40,P=0.027),而IDI 分析显示将大内皮素-1≥0.55pmol/L可显著提高模型对全因死亡和复合终点事件的预测能力,分别提高0.018(95%CI 0.001-0.041,P=0.013)对和 0.012(95%CI 0.000-0.031,P=0.033)。结论:升高的血浆大内皮素-1与房颤患者全因死亡、复合终点事件以及心血管死亡独立相关,NRI和IDI分析显示大内皮素-1 ≥ 0.55 pmol/L可显著提高模型对全因死亡和复合终点事件的预测能力,提示血浆大内皮素-1可为房颤患者不良预后提供预测价值。