论文部分内容阅读
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是全球第四大粮食作物,仅次于小麦、稻谷和玉米。2015年,农业部将马铃薯主粮化工作列入重要议程。马铃薯在我国的种植范围很广,环境胁迫是限制马铃薯产量和品质进一步提高的主要瓶颈之一。马铃薯在受到环境胁迫后,会有不同程度的减产,严重的甚至减产70%左右。前期,我们从烟草中克隆得到一个编码非特异性脂转移蛋白的基因Nt LTP4,研究表明,超表达Nt LTP4基因能够增强烟草对非生物胁迫和生物胁迫的耐受性。在此基础上,本研究开展了Nt LTP4基因转化马铃薯的研究,培育获得了抗盐碱、干旱和青枯病的马铃薯新种质,为马铃薯品种改良奠定了基础。主要的研究结果和结论如下:(1)ubi3启动子的克隆及表达活性分析利用PCR技术,从马铃薯克隆了ubi3启动子,该启动子长度为921bp。将ubi3启动子插入p X6载体中,获得载体ubi3::p X6。进而,在载体ubi3::p X6中ubi3启动子的下游插入GFP基因,构建带GFP标签植物表达载体ubi3::p X6-GFP。用载体ubi3::p X6-GFP侵染烟草,2d后在上部叶片观察到荧光,说明ubi3具有启动子活性,可以启动下游基因的正常表达。(2)Nt LTP4基因过表达载体的构建及基因转化设计含有适宜酶切位点的引物,PCR克隆Nt LTP4基因,插入载体ubi3::pX6的ubi3启动子下游,获得了Nt LTP4基因过表达载体ubi3::p X6-Nt LTP4。将ubi3::p X6-Nt LTP4载体导入农杆菌,利用农杆菌介导法转化马铃薯,共获得了18个株系。PCR检测结果显示,其中15株为Nt LTP4阳性株系;进一步的q RT-PCR检测结果显示,株系L2、L9、L11、L12、L13中Nt LTP4基因的表达量较高。对这5个株系进行Southern blot检测,结果显示5个株系都检测到了杂交信号,且信号条带数量1-4条,表明在这些转基因植株中至少存在1-4个拷贝Nt LTP4基因;Western blot检测结果显示,5个株系都检测到了蛋白杂交信号,蛋白分子大小约为12KDa,表明这些转基因株系中Nt LTP4基因都成功表达。(3)Nt LTP4过表达马铃薯株系的抗逆性鉴定根据基因表达的检测结果,从Nt LTP4过表达马铃薯株系中选取了Nt LTP4表达量较高的3个株系(L11、L12、L13)进行盐胁迫、干旱胁迫以及侵染青枯菌,对其抗逆性进行检测。结果显示,转基因马铃薯株系在高盐环境下长势优于野生型马铃薯,而且Nt LTP4表达量越高,马铃薯的耐盐性越强;转基因株系在干旱条件下的存活率高于野生型株系,且Nt LTP4表达量越高,马铃薯的存活率越高,对干旱的耐受性效果越好;接种青枯菌的转基因株系发病率以及发病程度都低于野生型株系,且Nt LTP4的表达量越高,马铃薯的青枯病发病率、发病程度越低,对青枯菌的抗性更强。上述结果表明过表达Nt LTP4能够提高马铃薯对非生物胁迫(高盐、干旱)以及生物胁迫(青枯菌)的抗性,且该基因表达量越高,植物的对非生物和生物胁迫的耐受性越好。