【摘 要】
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目的:本实验针对肝肾阴虚动物模型和肝肾阴虚体质者进行代谢组组学研究,以明确肝肾阴虚证型的物质基础,探究肝肾阴虚证型发生发展机制,为肝肾阴虚证型的临床辨证施治提供客观依据。方法:1.肝肾阴虚动物模型建立SD大鼠适应性喂养7天后开始造模,将48只大鼠随机分为4组:空白组12只、肝肾阴虚激怒组12只、肝肾阴虚中药组12只、肝肾阴虚西药组12只,各组均以普通饲料喂养。激怒组采用夹尾激怒方法造模,中药组灌服
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81960743）； 江西省双一流学科中医建设项目（JXSYLXK-ZHYI026）； 江西中医药大学资助项目（2014ZR021）；
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目的:本实验针对肝肾阴虚动物模型和肝肾阴虚体质者进行代谢组组学研究,以明确肝肾阴虚证型的物质基础,探究肝肾阴虚证型发生发展机制,为肝肾阴虚证型的临床辨证施治提供客观依据。方法:1.肝肾阴虚动物模型建立SD大鼠适应性喂养7天后开始造模,将48只大鼠随机分为4组:空白组12只、肝肾阴虚激怒组12只、肝肾阴虚中药组12只、肝肾阴虚西药组12只,各组均以普通饲料喂养。激怒组采用夹尾激怒方法造模,中药组灌服干姜-附子浓缩液,西药组灌服甲状腺素-利血平混悬液,空白组和激怒组灌服等体积生理盐水,灌胃体积均为10 m L/kg/d,造模过程动态观测动物体征,6周后进行生化指标检测。2.肝肾阴虚动物模型评价通过对大鼠一般状况观察、生物阻抗频谱技术检测、实验动物脏器系数、病理学形态观察,进行模型评价。每周记录各组大鼠的身体外观和行为状态;定时定点测量饮水量、饮食量、体重、体温;利用生物阻抗频谱技术每周检测大鼠体液总量、细胞外液、细胞内液、脂肪含量、非脂肪含量情况;实验结束后检测大鼠肝脏指数、肾脏指数;取其肝、肾组织,运用苏木精-伊红染色观察肝肾组织病理学变化情况。3.肝肾阴虚动物模型及肝肾阴虚体质者的代谢组学研究采用基于LC-MS技术的非靶向代谢组学方法,检测分析大鼠第2、4、6三周血清的时序性代谢物变化及实验结束时大鼠肝、肾组织代谢物变化;检测分析志愿者血清代谢组变化,对代谢产物进行多元统计分析以及数据库比对,鉴定潜在的生物标记物,再通过代谢通路的富集分析来阐述肝肾阴虚证型的发生发展机制。结果:1.造模6周后,与空白组相比,模型组大鼠均出现形体瘦削、毛色无光甚至脱毛、躁动不安、小便黄数、大便干结等肝肾阴虚症状。对肝肾阴虚动物模型进行评价,与空白组相比,体征积分:肝肾阴虚模型组积分增高;饮水、饮食观测:肝肾阴虚模型组均有显著性差异;体重观测:模型组大鼠体重均低于空白组,增长相对缓慢;体温观测:模型组大鼠体温升高;生物阻抗频谱技术检测:激怒组体液总量百分比升高、脂肪含量百分比降低;中药组细胞外液百分比升高、细胞内液百分比降低。进行生化指标检测,结果显示,与空白组相比,三组模型组E2、c AMP、ALT、AST以及c AMP/c GMP、E2/T比值升高,c GMP、T降低,提示模型造模成功。肝肾脏器指数:中药组肝脏指数增大,西药组肝脏指数和肾脏指数增大;肝肾组织形态学观察结果见病理学改变。2.正、负离子模式下,空白组和肝肾阴虚模型组大鼠血清和肝肾组织、平和组和肝肾阴虚组血清在QC样本间分离较好。代谢物经过筛选后,再和HMDB、KEGG等数据库对比,然后对鉴定出的代谢产物进行通路富集分析。大鼠血清时序性代谢组学结果显示:第2周大鼠血清代谢结果鉴定出51个代谢产物,显著代谢通路有5条:鞘脂代谢、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、酪氨酸代谢;第4周大鼠血清代谢结果鉴定出50个代谢产物,显著代谢通路有2条:甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢;第6周大鼠血清代谢结果鉴定出34个代谢产物,显著代谢通路有4条:甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢、视黄醇代谢。大鼠肝肾组织代谢组学结果显示:大鼠肝脏组织代谢结果鉴定出78个代谢产物,显著代谢通路有4条:鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢、泛酸和Co A生物合成;大鼠肾脏组织代谢结果鉴定出30个代谢产物,显著代谢通路有1条:甘油磷脂代谢。肝肾阴虚体质者血清代谢结果显示:鉴定出12个代谢产物,显著代谢通路有1条:鞘脂代谢。因此,大鼠第6周血清、肝脏组织、肾脏组织代谢组学总和的代谢通路有甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、鞘脂代谢、视黄醇代谢、α-亚麻酸代谢、泛酸和Co A生物合成;与肝肾阴虚体质者血清代谢组学结果相同的代谢途径是鞘脂代谢。结论:通过对不同造模方法的肝肾阴虚动物模型研究发现:肝肾阴虚证型发生机制可能是通过干预花生四烯酸代谢、鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢、泛酸和Co A生物合成、视黄醇代谢途径对大鼠的肝肾组织等造成损伤,发挥“伤阴”的作用。综上所述,机体内的脂代谢、辅助因子和维生素代谢异常可能是中医肝肾阴虚证型形成的关键点。通过动物实验和临床实验对比研究发现:机体内的鞘脂代谢的异常是肝肾阴虚证型发生发展机制的重要因素。
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