漆酶(EC1.10.3.2)是一种含有四个铜离子的多酚氧化酶,属于蓝色多铜氧化酶(MCOs)家族。漆酶广泛分布于自然界中,其来源有真菌、细菌、动物和植物等。在漆酶催化过程中,底物在T1Cu位点被氧化,经过电子传递,在三核铜中心将O2还原为H2O。漆酶的底物谱非常广泛,且它催化的反应不产生有毒副产物,因此被认为是一种极具应用价值的绿色催化剂。来源于Thermus thermophiles SG0.5JP17-16的漆酶(lacTT)是一种耐高温、pH耐受范围广、耐受高浓度盐的细菌漆酶,本研究以lacTT为研究对象,探究了 lacTT中相关氨基酸在酶分子底物氧化过程中的功能,具体研究内容及结果如下:首先,本课题研究了 T1 Cu轴向氨基酸残基M460在漆酶lacTT催化中的作用,采用定点突变的方法将M460分别突变为丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、组氨酸和谷氨酰胺。紫外可见光谱学及酶促反应动力学数据表明,与野生型相比,弱配位残基取代M460会导致T1Cu位点铜离子装载量减少,以愈创木酚为底物,酶的催化效率升高,强配位残基取代M460会使T1Cu位点铜离子装载量增加,酶的催化效率降低。该位点的替换还会影响T1 Cu位点的氧化还原电位,随着突变体中T1 Cu轴向配体与金属铜离子相互作用的增强,T1Cu位点的氧化还原电位降低。综上所述,T1Cu轴向残基的类型是影响T1 Cu位点氧化还原电位和催化行为的重要因素。其次,本课题还探究了漆酶lacTT底物结合口袋入口处的极性氨基酸Lys428的功能。通过定点突变将Lys428分别突变为亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和蛋氨酸。紫外可见吸收光谱和圆二色谱的结果表明,K428突变为极性氨基酸谷氨酸和精氨酸对酶的铜中心和蛋白二级结构影响较小,其催化效率的降低主要与底物亲和力有关;K428突变为亮氨酸和甲硫氨酸时,K428L和K428M突变体的铜中心发生扰动,T1Cu位点铜离子装载量降低,二级结构受到影响。综合紫外可见吸收光谱和酶促反应动力学测定结果表明,K428L和K428M变异体的催化效率高于野生漆酶,但由于T1 Cu位点铜离子装载量降低,K428L突变体的比酶活降低。通过对工业染料的脱色研究表明,突变体K428M对活性黑B和活性黑WNN的脱色性能与漆酶lacTT相似,对刚果红和活性艳蓝的脱色性能优于lacTT。K428M变异体可能是本研究中发现的一个正突变漆酶。