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目的:DNA重组酶Cre及其作用位点loxP组成的细胞标记系统在研究胰腺发育及成体胰岛Beta形成过程中具有重要作用。本研究组前期研究发现Cre重组酶严重放大胰岛素启动子RIP非特异活性,对此我们采用点突变的方式对Cre进行改造,降低其酶活性,使胰岛素启动子RIP控制的Cre-loxP系统标记胰岛Beta细胞的特异性提高约15倍;进一步发现经典的可诱导型Cre,即定位于胞浆的与雌激素受体融合的CreER具有强烈的泄露现象,这使得利用此系统作为研究工具的实验设计存在明显漏洞。因此我们对Cre进行彻底改造,构建新型膜定位可诱导Cre标记系统及新型条件内含肽激活的Cre标记系统,有望解决CreER的自发泄露问题,从而提高可诱导Cre-loxP系统的严谨性。 方法:通过分子生物学技术构建可诱导Cre表达载体pCMV-CreER,pRIP-CreER和pMIP-CreER,检测CMV启动子及胰岛素启动子控制下CreER的泄露情况。通过点突变技术构建可诱导的突变型Cre表达载体pCMV-CreER(H289P)和pCMV-CreER(H289T),分析突变型CreER的自发泄露现象。我们还构建膜定位Cre表达质粒pCMV-imCre及内含肽激活的Cre表达质粒pCMV-ciaCre,以检测新型可诱导Cre-loxP系统的自发泄露情况。 结果:我们成功构建了可诱导pCMV-CreER,pRIP-CreER和pMIP-CreER表达载体,并验证发现CMV,RIP及MIP启动子控制下CreER存在严重泄露现象。通过点突变获得pCMV-CreER(H289P)和pCMV-CreER(H289T)表达载体验证发现,减弱Cre酶活性可以明显降低CreER的泄露,但细胞标记效率不理想。另外,我们构建了膜定位质粒pCMV-imCre,染色结果表明imCre确实定位在细胞膜上,然而,该系统似乎没有重组活性。我们又构建了内含肽激活的Cre表达质粒pCMV-ciaCre,但目前仍未检测到该系统的重组活性。 结论:CMV及胰岛素启动子控制下的CreER存在严重的泄露现象。通过点突变减弱Cre酶活,可降低CreER自发泄露程度,但细胞标记效率不理想。而新型膜定位Cre及内含肽激活的Cre表达质粒虽已构建成功,但未能检测到Cre介导的DNA重组活性,其原因有待今后进一步的研究。