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温度是限制植物地理分布和生长发育的主要因素之一,低温会给植物的产量造成巨大的损失。榛子是重要的落叶木本植物,具有极大的经济价值和生态效益,而且与其他木本植物相比具有基因组小、结果早、易于研究的优势,可以作为研究桦木科乃至壳斗目植物代谢过程的模式物种;世界上广泛种植的是欧洲榛,具有果大皮薄等优点但不抗寒,在我国广泛分布的平榛能耐受-48℃的低温,但目前为止公共数据库中还没有榛子抗寒相关的分子生物学信息,本研究以寒冬时期的平榛花芽为试材,采用Solexa高通量测序技术进行转录组分析,从中筛选出大量的冷调节基因,采用RT-PCR技术研究了20个基因对不同低温条件的表达差异,并选择转录因子CBF和功能基因脱水素基因进行初步的功能分析,结果将为以后的榛子抗寒遗传改良提供基因资源,也为进一步了解榛子越冬分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1.利用平榛寒冬时期的花芽为材料建立cDNA文库,接着在Illumina上采用Solexa技术进行序列测定,总共进行了13,815,180次读数,共获得有效序列2,030,831,460 nt。序列经组装得到129,912个Contig,53,471个独立的Singleton,进一步拼接后,共获得43,285个Unigene。按照GO的分子功能、生物过程和细胞组分等3个不同分类角度对被注释的3,890个具有同源性匹配的基因序列进行分类。在具有功能注释的43,285个Unigene中,通过进一步Blastn比对,根据“基因结构相似,功能同源”的原理,在平榛花芽转录组文库中筛选到几十条冷调节相关的Unigene,分别涉及转录、信号转导、抗性、细胞壁代谢、碳代谢、氮代谢、脂肪酸代谢、多胺代谢、渗调物质等功能类别,对其中20个假定的冷调节基因（包括14-3-3、HSP22、GPAT、WCOR413-PM、ADF、bzip78、ICE、CIP、NAC、PHD、ENO、HD、DOF、SPDS、NIR、BADH、BAM、ERD7、KT、SATO）进行全长克隆并设计引物采用荧光定量PCR手段对越冬过程中的四个时间点进行了表达分析,2个基因在冷适应时期（CA）表达量最大,18个基因在寒冬时期（MW）出现最大表达丰度;采用半定量RT-PCR方法研究了20个基因对低温胁迫的响应,转录因子一般出现在低温胁迫后的2-4h之内,功能基因对低温的响应较慢;另外采用半定量RT-PCR方法还研究了20个基因在冷适应时期两种榛属植物平榛和欧洲榛中的表达差异,大部分基因在平榛中表达强度比欧洲榛高。2.适当的内参基因选择是进行基因表达研究的前提,本研究采用半定量RT-PCR方法对ChACTIN、ChMDH、ChUBQ和ChEF1α四个内参基因在冷胁迫条件下和不同器官中的表达进行了研究,结果发现ChACTIN是最稳定的。3.从平榛花芽转录组文库中筛选得到两个CBF基因:CBF1和CBF2,CBF1的最大表达量出现在寒冬时期,CBF2最大表达量出现在冷适应时期,推测两者分别主要参与平榛的抗冻和抗冷,共同完成平榛的越冬过程;CBF1和CBF2分别在4°C处理后8h和4h转录本累积量最大;空间表达结果表明CBF1主要在雄花序中表达,CBF2主要在花芽中表达。CBF2在两种生态型的榛属植物中存在序列多态性,这种氨基酸的突变可能导致转录结合活性的差异。同时pBI121-CBF2-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达也验证了CBF2的核定位功能。4.通过RACE技术获得两个DHN基因的全长序列,DHN1包含一个长度为339 bp的开放读码框,编码一个含112个氨基酸的蛋白质,5’非翻译区长60 bp,3’非翻译区长98 bp,属于K2S类型DHN,在DHN1基因的3’非编码区域含有97bp的内含子,Genebank注册号:HM228388;DHN2包含一个长度为504bp的开放读码框,编码一个含167个氨基酸的蛋白质,5’非翻译区长41 bp,3’非翻译区长94 bp,该DHN2基因属于Y4SK2类型DHN,扩增基因组的对应区段发现在DHN2基因中间区段含有95bp的内含子序列,GenBank登录号为HM228389。冷激处理后ChDHN2基因表现逐渐地上调表达趋势,24 h达到最大表达量,在种子中高丰度表达。利用基因组步移法获取了两个DHN基因的5’侧翼序列,采用PLANTCARE软件分析顺式作用元件,除了含有胁迫响应元件MYB核心序列、ABRE或MYCR等元件外,DHN1还含有一个CRT低温响应元件。构建原核表达载体pET30（a+）-ChDHN2,在大肠杆菌BL21中表达出约30KDa的融合蛋白,过表达ChDHN2提高了大肠杆菌对低温胁迫的抗性。构建植物正义表达载体PBI121-ChDHN2,利用农杆菌介导转化烟草,低温处理后转基因烟草的冷害症状轻于野生型烟草,转基因烟草细胞电解质外渗较少和MDA累积量较低,这些实验结果说明DHN2的异源表达提高了植物的抗寒性。