目前广泛应用的磷脂酶A₂（PLA₂）主要来源于哺乳动物体内，如蜂毒、蛇毒等，但相比较而言，微生物来源PLA₂在规模化生产上具有更大的优势，所以本文从干酪乳杆菌中克隆得到磷脂酶A₂基因，在不同载体中表达出具有活性的目的蛋白，并对重组菌的发酵产酶条件进行摇瓶发酵条件优化，以期获得较高的酶活，通过目的蛋白纯化后对其酶学性质及水解大豆卵磷脂的条件进行初步分析，研究其实际应用范围。以干酪乳杆菌染色体基因组为模板PCR扩增出编码磷脂酶A₂的成熟肽基因pla2a。构建克隆质粒pMD-pla2a，测序后比对结果相似度均在99%以上。构建的重组表达质粒pET28a-pla2a转化大肠杆菌，成功构建重组大肠杆菌（pET28a-pla2a）硼砂卵黄平板检测具有磷脂酶A₂活性，SDS-PAGE电泳检测分子量约为17kDa，与预期大小一致。对重组菌E.coli-pET28a-pla2a的发酵条件进行优化，在LB培养基中IPTG的最佳诱导条件：IPTG加入时间2h，诱导温度25℃，诱导剂浓度0.1mmol/L，诱导时间4h，最高酶活为2.8±0.2U/mL；LB培养基中，乳糖诱导的最佳条件为：乳糖加入时间2h，诱导温度为25℃，诱导时间为6h，酶活达到2.5±0.2U/mL；TB培养基中，乳糖诱导条件：加入时间3h，诱导温度25℃，诱导时间为10h，最大酶活为3.0±0.2U/mL。以干酪乳杆菌染色体基因组为模板PCR扩增出编码磷脂酶A₂的全基因pla2b。成功构建重组表达质粒pHY-P43-pla2b和pPIC-CP-pla2a，对重组枯草芽孢杆菌（pHY-P43-pla2b）和重组毕赤酵母（pPIC-CP-pla2a）各生长阶段的酶活力测定显示，重组菌枯草芽孢杆菌（pHY-P43-pla2b）最大酶活为1.5±0.2U/mL。重组毕赤酵母（pPIC-CP-pla2a）酶活最大为2.0±0.2U/mL。通过Ni-螯合柱对重组酶进行纯化，SDS-PAGE分析得到的目的蛋白纯度在95%以上，比酶活为110U/mg。对磷脂酶A₂的酶学性质分析后显示，重组酶的最适反应温度为37℃，最适pH为8.0，在50℃以下具有较好的热稳定性，并且在65℃保温1h酶活基本不变。以大豆磷脂为底物，研究了本实验发酵得到的磷脂酶A₂水解磷脂的条件为：酶浓度2.5U/g，反应温度37℃，起始pH8.0，Ca²⁺浓度50mmol/L，反应时间8h，每克磷脂生成游离脂肪酸的量为781μmol，磷脂平均转化率为60.6%。