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目的：子痫前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorderscomplication pregnancy,HDCP)中常见的一种类型,为妊娠期特有的一种疾病,可伴有心、脑、肝、肾等多种脏器功能损害,是孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一。临床特点是:妊娠20周后出现持续性高血压、蛋白尿、水肿等症状,并于分娩后上述症状逐渐减轻,产后12周消失。其流行病学特征主要表现为:多发生于首次接触绒毛组织的妊娠者;母体与绒毛组织接触过多的妊娠者,如双胎、葡萄胎、糖尿病等;有妊娠期高血压疾病遗传倾向者。关于子痫前期的发病机制一直都是围产医学领域研究的热点,目前研究公认的发病机制有:滋养细胞功能异常学说、免疫调节功能异常导致的母-胎界面免疫失衡学说、遗传学说、氧化应激学说。近年来学者们越来越关注免疫遗传机制在子痫前期中的发病作用。子痫前期的发生与母体免疫状态的改变密切相关,而且其特征性病理变化就是子宫螺旋小动脉生理性铸障碍,出现急性动脉粥样硬化性改变,和急性移植排斥反应的免疫异常相似。人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)在器官移植过程中是引起移植排斥反应的主要组织相容性抗原,作为免疫学上一个重要的免疫遗传因子,其多态性的研究也是生殖免疫和遗传学的热点,则其在子痫前期的发病中也起着不可忽视的作用。子痫前期过去往往被认为是孕妇单方面的疾病,其实正常妊娠是一种成功的半同种移植现象,携带有父源性基因的胎儿作为半同种移植物植入母体内并没有发生母胎排斥现象,反而形成一种免疫耐受,说明免疫机制在妊娠过程中起着重要的作用。母体对胎儿所携带的父源性HLA基因的免疫识别作用可能参与子痫前期的发病。并且以往我们课题组的研究结果发现:(1)父源性HLA-DRB1*04基因可能与子痫前期易感性相关;(2)夫妇间的某些特定HLA-A基因配伍模式与子痫前期的发病相关。本实验主要通过对子痫前期患者及其配偶免疫功能及遗传背景的研究来探讨HLA-B基因多态性与子痫前期的相关性,将有助于深入探讨疾病的发生机制,并为该病的防治提供理论依据。
方法：⑴选择2008年10月至2010年12月在郑州大学第三附属医院产科住院,经临床确诊的92例子痫前期患者,其中收集到丈夫血液的37例为病例组。诊断标准按人民卫生出版社第七版《妇产科学》,所用研究对象均排除内分泌疾病、慢性高血压病、肾脏疾病、糖尿病、肿瘤、炎症等,且所有子痫前期患者均随访至产后12周。另选择同期在我院产科住院分娩的正常健康孕妇95例,其中38例收集到丈夫血液为对照组,均因社会因素进行剖宫产。两组研究对象均为中国河南汉族人、无异族通婚史、无血缘关系、无内科合并症。⑵采用上海莱枫生物科技公司提供的哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒,按说明书进行操作。提取出的DNA用紫外分光光度计检测其浓度及纯度,DNA纯度A260/A280值为1.6～1.9,浓度调整至100 ng/μl,-20℃保存备用。⑶流式反向特异序列寡核苷酸探针(PCR-SSO)基因分型技术,试剂由上海复旦张江生物医药公司提供的优诺基HLA-SSO分型试剂盒。原理为:将大量基因探针包被于纳米大小的微珠上,与扩增的DNA片段杂交后在Luminex分析仪上读取,属于一种液体基因芯片技术。实验过程:(1)样本扩增:将样本DNA用无菌双蒸水稀释20～100ng/μl,纯度在1.65-2.0。取稀释DNA溶液,2μl,并加入Dmix缓冲液13.8μl,Primer(引物)4μl及Taq酶0.2μl,贴好封口膜震荡混匀,放入PCR仪中进行扩增,反应条件如下:96℃3min1个循环,95℃20s,60℃20s,72℃20s,5个循环,95℃10s,60℃15s,72℃20s,共35个循环,最后72℃延伸10 min。扩增完成后,以2％琼脂凝胶、取3μl扩增产物电泳检测扩增效果。80-100V电泳约20min。PCR扩增片段大小B位点:440bp。(2)样本杂交:在扩增好的DNA中加入BM(磁珠)和HM(磁珠缓冲液),震荡均匀后加入50μlSAPE(荧光液)在PCR仪上60℃孵育6min。反复洗涤后放入Luminex分析仪上读取样本。⑷采用SPSS16.0软件进行统计学分析,两组间的计量资料比较符合正态分布的用t检验,非正态分布计量资料用秩和检验。直接计算法计算等位基因频率,两组间等位基因分布差异用四格表法进行X2检验,n≥40且理论频数(T)≥5,用普通卡方检验;n≥40但1≤T＜5时,用校正的卡方检验;n＜40或T＜1时,Fisher精确概率。以α=0.05为检验水准。由于每例患者的HLA-B位点均有两个等位基因,故等位基因频率=观察基因数/2N,N为观察样本数。
结果：①子痫前期患者平均年龄(30.62±5.80)岁;平均孕周为(32.68±6.23)周;子痫前期组配偶的平均年龄为(32.95±6.73)岁。正常晚孕产妇平均年龄(29.39±5.08)岁,,平均孕周为(38.22±1.96)周;正常晚孕组配偶的平均年龄为(32.47±5.01)岁。两组研究对象除了孕妇的孕周有统计学差异(P＜0.05)外,孕妇年龄、配偶的年龄、均无统计学差异(P＞0.05)。②正常晚孕组95例和子痫前期组92例共检出34个HLA-B等位基因,正常晚孕组中HLA-B13(9.47%),-B46(9.47%),-B51(8.95%)基因出现频率相对较高;子痫前期组中HLA-B13(16.30%),-B61(9.24%)、-B62(8.70%)基因占较高频率。各等位基因频率差异均无统计学意义(P＞0.05)。③两组配偶中共检出28个HLA-B等位基因,正常晚孕组配偶中以HLA-B13(15.79%)、-B38(9.21%)、-B35(7.89%)、-B61(7.89%)基因频率最高;子痫前期配偶中则以HLA-B13(22.97%)、-B51(9.46%)、-B58(6.76%)、-B60(6.76%)基因频率最高,但两组间各等位基因频率之间差异均无统计学意义(P＞0.05)。④选择正常晚孕组和子痫前期组等位基因频率较高的(HLA-B13、-B46、-B51)等位基因,分析该基因在夫妇间的配伍情况发现:子痫前期组妇携带而夫不携带HLA-B13基因频率(35.14.81%)显著高于正常晚孕组(2.63%),P＜0.05;子痫前期组夫妇均不携带HLA-B13基因频率(21.62%)显著低于正常晚孕组(63.16%),P＜0.05。
结论：⑴父方因素在子痫前期发病中起着重要的作用。⑵夫妇间HLA-B13基因配伍模式与子痫前期的易感性和抗性相关。