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柠条锦鸡儿抗干旱、高温、寒冷,耐盐碱和贫瘠土壤,是我国西部等环境极端地区的重要栽培灌木品种和重要的饲料、制浆树种。但柠条的木质素含量较高,降低了柠条的饲用价值,增加了柠条纸浆开发的成本。因此进行柠条木质素生物合成调控方面的研究意义重大。 本论文以柠条锦鸡儿为实验材料,以木质素合成关键酶PAL为对象,进行了酶的纯化、酶活性的时空差异、编码基因的时空表达、编码基因片段的克隆、RNAi载体构建及RNAi序列对靶酶的调控效应等方面的研究工作。 实验结果表明:柠条干种子中存在微弱的PAL活性,当种子开始萌动后PAL活性迅速增加,活性比干种子增加近4倍,比活增加5倍多。从萌芽期到硬化期,在实验样品的根、茎、叶及相应器官中PAL活性和比活均呈现出小—大—小的类抛物线变化。叶器官中PAL活性从子叶期到速生期迅速增加,真叶期比子叶期增加2.2倍,速生期达到最大,比真叶期增加1.33倍。而硬化期活性降低,硬化期比速生期活性降低21%;茎中PAL活性从子叶期到速生期迅速增加,真叶期比子叶期增加1.48倍,速生期达到最大,比真叶期增加1.25倍。硬化期时活性大大降低,仅为速生期活性的48%;而根中PAL活性在真叶期达到最大,真叶期后活性降低,速生期、硬化期的活性分别为真叶期活性的49%和17%。各器官中PAL比活变化与活性变化基本相似。 速生期叶片中的PAL,经DEAE52离子交换层析分离,可以得到2个活性峰,分别在盐离子浓度约为0.4M和0.75M时出现。速生期茎中和真叶期根中的PAL,经DE52离子交换层析分离,均得到1个活性峰,在盐离子浓度约为0.4M时出现。分子筛层析表明:DEAE52中分离到的活性峰均为单一活性峰组分,0.4M盐离子洗脱峰分子量约为222KD;0.75M盐离子洗脱峰分子量约为306KD。SDS-PAGE结果表明:分子量为222KD的PAL全酶是由单一亚基组成的多聚体,亚基分子量为74KD;分子量为306KD的PAL全酶是由2种亚基组成的多聚体,亚基分子量分别为74KD和82KD。 以18SrRNA片段为内标探针,进行的半定量Northern杂交表明:柠条的不同器官和不同发育阶段,pal有不同的表达量。柠条存在2类pal编码基因,碱基数较少的b基因存在于所有样本中,而碱基数较多的a基因仅存在于叶片中。根部器官中palb基因的表达以子叶期为最高,分别约为真叶期、速生期和硬化期的1.24、1.94和5.17倍。茎中该基因以真叶期为最高,分别约为子叶期、速生期和硬化期的2.85、4.61和5.11倍。叶中该基因以真叶期为最高,分别约为子叶期、速生期和硬化期的2.69、3.56和4.48倍。仅存在于柠条叶中的pal a基因表达量变化趋势与b基因相似,以真叶期为最高,分别是子叶期、速生期和硬化期的2.82、1.93和2.38倍;但（1）a基因表达量差异比器官中b基因间的差异小;（2）a基因的表达量比同期b基因的表达量低,a基因的表达量与同期pal总表达量的比值随发育而升高。 对用TRIZOL法提取的真叶期、速生期、硬化期茎的RNA,进行了质量分析,结果表明:所提RNA样品中OD260/OD280均超过1.9;在电泳条带上28S/18S均超过2。 根据以DNA为模板扩增出的pal序列设计一对特异引物,以pal表达量最高的真叶期茎RNA为模板,利用RT-PCR进行扩增。扩增片段回收后连接到pGEM-T—Easy载体中,对T载体中插入的pal片段测序,对序列进行读码分析,登陆NCBI进行同源性比对,用DNAMAN软件与DNA为模