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猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV-3)是近些年发现的一种新型猪圆环病毒,在临床上能引起猪的多种疾病,给世界养猪业造成严重危害和巨大损失。现今,世界各国对PCV-3的研究尚处于起步阶段,检测方法还局限在分子生物学水平,尚无大规模诊断和预防PCV-3的方法,导致了商品化ELISA检测试剂盒和疫苗的缺口,因此各国研究学者正加紧针对PCV-3的进一步研究。目前报道表明,PCV-3 ORF2序列编码的重要结构蛋白Cap具有良好的免疫原性,能够诱导免疫反应,用其作为抗原研制ELISA检测试剂盒,有利于区分在临床症状上相似的PCV-3、PCV-2、PNDS等疾病,方便对规模化猪场进行PCV-3的大量检测和流行病学调查。为高效表达PCV-3 Cap蛋白,本研究以PCV-3 ORF2序列为模板,先对其序列上的稀有密码子进行简单优化(上海生工),针对优化后序列设计引物,扩增出625bp大小的目的片段,与带有His标签的pET-28a载体质粒分别进行酶切后连接成为重组质粒,转化到大肠杆菌表达菌株中,挑取阳性菌落,经酶切鉴定和测序验证后诱导表达,经SDS-Page和Western Blot验证表明ORF2基因在大肠杆菌终得以表达,目的蛋白大小为27kD左右。但因其表达量低,于是通过对序列上的稀有密码子定点突变为最佳密码子并截掉前端重复氨基酸序列,重新诱导表达,目的蛋白表达量得以大幅提升,经包涵体蛋白处理、亲和层析纯化和切胶纯化步骤,获得高纯度、高浓度目的蛋白。对上述纯化后的蛋白进行复性,经胶体金免疫印记实验验证,通过负染后透射电镜下观察,可见有“透明”高亮的圆形物质存在,大小在17nm~20nm左右,和PCV-3病毒粒子的大小形态相吻合,判断其为PCV-3病毒样粒子,表明通过透析法蛋白得以成功复性。以复性后蛋白为免疫原制备抗原,经3次免疫实验动物兔,得到含多克隆抗体的血清,以血清作为一抗,经Western Blot和ELISA方法鉴定,证实血清中的多克隆抗体具有良好特异性。本试验从分子生物学、形态学和血清学角度上研究证实了PCV-3 Cap蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,制备的多抗具有良好特异性,为制备PCV-3 ELISA检测试剂盒奠定基础。