背景:新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis,NEC）主要发生在极低出生体重儿的回肠结肠部位;自噬的过度激活可能会造成肠道细胞的损伤,腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化水平增加可以促进自噬的发生,AMPK-mTOR-ULK1ser757作为重要的自噬通路在体内发挥重要的作用。重组人促红细胞生成素除了用于早产性贫血的治疗,在肠道自噬中也发挥了重要作用。目的:本研究以NEC患儿的肠道组织、NEC新生儿大鼠模型及大鼠的肠上皮细胞IEC-6细胞为对象,采用多种实验技术,从整体、细胞和分子等不同水平,研究自噬及自噬通路AMPK-mTOR-ULK1ser757在NEC中的作用,研究rh-EPO能否通过降低NEC的自噬,减轻NEC的严重程度;验证rh-EPO是否通过降低AMPK的磷酸化水平,起到抑制AMPK-mTOR-ULK1ser757自噬通路的作用,从而起到肠道的保护作用。方法:第一部分---自噬相关蛋白在新生儿坏死性小肠中的表达采集自2020年3月-2021年12月于本院新生儿科确诊NEC并行外科手术的10例极低出生体重儿的肠管组织,按照术中坏死的严重程度及术后的病理分级作为参考,分为NEC组和对照组,采用HE染色对肠管标本进行染色,免疫组化检测自噬相关蛋白beclin1和p62的表达,免疫印迹比较两组AMPK-mTOR-ULK1ser757自噬通路的蛋白表达。第二部分---NEC动物模型的建立选取刚出生的Sprague-Dawley（SD）大鼠,在出生后24小时、48小时、72小时采用联合低氧（8%氧气和92%氮气混合气,低氧60秒）、寒冷（4℃环境,10分钟）、不同浓度的脂多糖（LPS）灌胃的方法建立新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）的模型。在出生后96小时进行处死,取回盲部上段的回肠部分。通过比较不同组别的一般情况、体重变化、存活率;通过HE染色观察肠管的病理形态及Nadler分级（Nadler≥2级考虑NEC造模成功）,选择最佳的造模方法。第三部分—自噬对NEC的影响及促红细胞生成素在自噬中的作用将刚出生的新生大鼠按照处理方式不同分为对照组、NEC组、NEC+EPO组、NEC+rapamycin组、NEC+rapamycin+EPO组。在生后24小时、48小时、72小时按照组别进行不同的处理方式,在出生后96小时心脏取血进行离心,分离血清备用,后处死后取回盲部上段的回肠。血清学用于ELISA检测炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α。留取回盲部上段回肠部分,电镜下观察自噬小体;HE染色观察病理情况及Nadler评分,免疫组化检测自噬相关蛋白beclin1、p62及凋亡相关蛋白caspase-3、bcl-2的表达;免疫印迹检测自噬相关蛋白beclin1、p62及凋亡相关蛋白caspase-3、bcl-2。免疫印迹比较NEC组和NEC+EPO组自噬通路AMPK-mTOR-ULK1ser757的蛋白表达。第四部分---rh-EPO在IEC-6肠上皮细胞AMPK-mTOR-Ulk1ser757通路的作用将IEC-6细胞按照处理方式不同分为对照组、LPS组、LPS+EPO组、LPS+AICAR组和LPS+AICAR+EPO组。通过流式细胞术观察细胞凋亡情况;通过免疫荧光、RT-q PCR、免疫印迹观察不同组别在自噬蛋白beclin1、p62及凋亡相关蛋白caspase-3、bcl-2的表达情况;免疫印迹观察EPO对AMPK的磷酸化水平的影响,是否能够通过抑制AMPK-mTOR-ULK1ser757自噬通路,减少细胞凋亡。结果:第一部分---自噬相关蛋白在新生儿坏死性小肠中的表达NEC组的肠道组织Nadler分级高于对照组,自噬相关蛋白beclin1表达增高,p62蛋白表达降低,差异显著。NEC组p-AMPK表达高于对照组,p-mTOR及p-ULK1ser757表达低于对照组,差异显著。第二部分---新生儿坏死性小肠结肠炎动物模型的建立低氧寒冷联合LPS（20mg/kg）灌胃的方法是建立NEC模型的造模方法,造模成功率超过80%。。第三部分---自噬对NEC的影响及rh-EPO在NEC自噬中的作用NEC与对照组相比,beclin1表达增高、p62表达降低,电镜下提示自噬小体增多,Nadler分级增高,caspase-3表达增高、bcl-2表达降低,TNF-α、IL-6、IL-1β炎性因子表达增高;NEC+rapamycin组与NEC组相比,beclin1表达增高、p62表达降低,电镜下提示自噬小体增多,Nadler分级增高,caspase-3表达增高、bcl-2表达降低,TNF-α、IL-6、IL-1β炎性因子表达增高;NEC+rapamycin+EPO组与NEC+rapamycin组相比,beclin1表达降低、p62表达增高,电镜下提示自噬小体减少,Nadler分级降低,caspase-3表达减低、bcl-2表达增高,TNF-α、IL-6、IL-1β炎性因子表达减低;NEC+EPO组和NEC组相比,p-AMPK表达减低、p-mTOR和p-ULK1ser757表达增强。第四部分---rh-EPO在IEC-6肠上皮细胞AMPK-mTOR-Ulk1通路的作用机制LPS组与对照组相比,beclin1表达增高、p62表达降低,caspase-3表达增高、bcl-2表达降低;LPS+EPO组与LPS组相比,beclin1表达降低、p62表达增高,caspase-3表达降低、bcl-2表达增高;LPS+AICAR组与LPS组相比,p-AMPK表达增高,p-mTOR、p-ULK1ser757表达减低,beclin1表达增高、p62表达减低,caspase-3表达增强、bcl-2表达降低;LPS+AICAR+EPO组与LPS+AICAR组相比,p-AMPK表达减低,p-mTOR、p-ULK1ser757表达增强,beclin1表达降低、p62表达增高,caspase-3表达降低、bcl-2表达增高。结论:NEC组的肠道组织自噬增强,AMPK-mTOR-ULK1ser757可能参与肠道的自噬。寒冷低氧联合LPS（20mg/kg）灌胃的方法是建立NEC模型的造模方法,造模成功率超过80%。自噬激活可能会导致肠道凋亡、炎性因子增加,rh-EPO可能通过参与AMPK-mTOR-ULK1ser757通路来减少自噬,从而减轻NEC的严重程度。自噬可能参与了IEC-6细胞的凋亡,rh-EPO可能通过抑制自噬减少IEC-6细胞的凋亡,其机制可能是通过抑制AMPK-mTOR-ULK1ser757通路的AMPK磷酸化水平,从而起到肠道上皮细胞的保护作用。