乳腺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤,其发病率在我国呈明显上升趋势。乳腺癌的发生涉及到多种因素,其中包括了多种基因的异常,如癌基因、抑癌基因和肿瘤易感基因的表达异常。这些基因在乳腺癌的发生、发展过程中起着重要作用。转化生长因子P(transforming growth factor)家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子亚家族组成,其中包括抑制素(inhibin)、活化素(activin)、骨形态发生蛋白(BMP)等。TGF-β超家族在调节细胞的生长、分化、凋亡、黏附、细胞外基质合成与沉积、胚胎发生和组织修复、炎症反应及纤维化中起着重要的作用。通路中任一环节的变化,都会导致信号转导异常,从而影响肿瘤的发生、发展。抑制素(inhibin)是由性腺和胎盘分泌的激素,在结构上属于转化生长因子β(TGF-p)家族的成员。研究发现抑制素系焦磷酸盐样的糖蛋白二聚体,由α及p两个亚基以二硫键的形式(一S—S)偶联构成,其作用主要是抑制垂体卵泡刺激素(FSH)的生成。其中的α亚基就是由INHA基因所编码的,基因全长1101个碱基,编码366个氨基酸的蛋白,含有TGF-β超家族结构域,提示此基因可能具有和TGF-β家族成员在肿瘤中相似的生物学特点。然而INHA在肿瘤中的作用机制,目前仍是不明,特别是在乳腺癌。文献报道INHA在乳腺癌中的研究多停留在临床标本的检测而且存在较多的争议,还未涉及其作用机制的研究报道。因此,本项目以乳腺癌为研究对象,采用病毒表达技术、RNA干扰、蛋白质组技术等现代实验方法,对INHA潜在的生理功能以及其在乳腺癌中的作用进行研究。研究方法：1. INHA单克隆抗体的制备采用多肽合成抗原的方法制备分别针对INHA N端和C端的单克隆抗体,并对抗体的特异性进行鉴定。2. INHA在12种肿瘤组织中(癌和癌旁配对)的表达检测。采用免疫组化技术检测12种肿瘤组织中的表达水平的差异。3.乳腺癌患者癌组织、癌旁组织中以及乳腺相关疾病中INHA的表达检测。采用免疫组化技术检测乳腺癌患者癌组织、癌旁组织以及乳腺相关疾病中INHA蛋白表达水平的差异。4.稳定高表达INHA细胞系的构建.4.1采用PCR法获得目的基因INHA,用pmeI酶切后把目的片段与慢病毒表达载体pWPI-IRES相连,得到重组质粒pWPI-IRES/INHA,测序正确后用于病毒包装和感染乳腺癌细胞MDA-MB-231以及MCF-7。4.2采用瞬时转染293FT的方法包装病毒颗粒然后感染乳腺癌细胞MDA-MB-231以及MCF-7。4.3采用流式细胞仪进行细胞分选,分离出荧光强度大的细胞。对该能发强荧光的克隆进行鉴定和冻存,从而获得稳定高表达目标序列的细胞克隆。5.稳定干扰INHA细胞系的构建.采用吉玛公司设计包装的特异干扰INHA基因的慢病毒颗粒感染MDA-MB-231以及MCF-7细胞。对上述细胞进行流式分选和Western Blot鉴定后,获得重组细胞系。6.稳定高表达和干扰INHA细胞系的鉴定6.1采用实时荧光定量RT-PCR鉴定稳定干扰的细胞6.2采用Western blot鉴定稳定高表达INHA和稳定干扰INHA的细胞7. INHA对乳腺癌细胞生长的影响采用CCK8检测法法观察转染高表达和干扰载体后细胞的增殖情况并绘制细胞生长曲线,并同时分别设置相应的对照细胞。8.干扰INHA基因对乳腺癌细胞皮下成瘤的影响采用干扰INHA基因以及对照组的MCF-7乳腺癌细胞系进行裸鼠成瘤实验,然后采集数据进行分析。9.通过2D/MALDI-TOF/TOF蛋白质组学方法分析细胞MCF-7/NC和MCF-7/CD的差异表达蛋白,并对相关蛋白Western Blot进行鉴定。10.对通过蛋白质组学分析到的可能相关通路或蛋白进行进一步研究。结果：1.成功制备了分别针对INHA N端和C端的单克隆抗体,免疫荧光和Western Blot的鉴定都说明了我们制备的抗体具有特异性。2. INHA蛋白在肿瘤组织中的组化分析。2.112种肿瘤组织中INHA的表达差异免疫组化分析结果显示,在食道,胃,肝脏,直肠,肺,乳腺,宫颈,卵巢和前列腺中INHA的表达都是癌组织明显低于癌旁组织的,其在结肠和肾脏中癌组织和癌旁组织的表达差异不明显,而INHA在胰腺中癌组织的表达高于癌旁组织。2.2乳腺癌组织以及癌旁组织中INHA的表达差异用两株抗体(C1和N2)分别检测INHA在乳腺癌中的表达,结果显示两种抗体在乳腺癌的癌和癌旁组织中较一致,癌与癌旁比较均有显著差异(t=12.61,p<0.001)和(t=12.82,p<0.001),其差值均数分别为7.33和8.08,癌旁组织中INHA(C1和N2)的表达均显著高于癌组织。2.3乳腺相关疾病中INHA的表达差异免疫组化分析结果显示,用两株抗体分别检测了INHA在不同乳腺相关疾病中的表达情况,发现在不同种乳腺疾病中呈现良性病变和癌旁的表达量均高于各种乳腺癌组织,但是在癌肉瘤中两株抗体的检测结果不相一致。3.基因克隆成功构建了重组质粒pWPI-IRES/INHA。4.用293FT细胞进行病毒包装,并成功构建了高表达和干扰INHA的MCF-7、MDA-MB-231的细胞系。5.体外实验显示,干扰INHA后显示抑制乳腺癌细胞的生长CCK8细胞增殖实验研究结果表明,乳腺癌细胞转染干扰表达载体后,统计学分析显示干扰INHA基因后MCF-7细胞增殖能力降低(P<0.05)。6.干扰INHA基因对乳腺癌细胞皮下成瘤的影响对裸鼠成瘤采集数据,分析结果显示,干扰下调INHA抑制了MCF-7细胞的裸鼠皮下成瘤能力。7.2D/MALDI-TOF/TOF蛋白质组学方法分析细胞MCF-7/NC和MCF-7/CD的差异表达蛋白,并对相关蛋白Western Blot进行鉴定。分析干扰INHA的MCF-7细胞蛋白表达谱显示干扰INHA能使一些肿瘤促进蛋白表达下降,其中包括了一些细胞周期调控蛋白,提示INHA可能与细胞周期的调控有关。8. INHA基因影响乳腺癌细胞的作用机制。8.1流式细胞术检测细胞周期检测结果显示：干扰INHA基因转染乳腺癌细胞MCF-7后,乳腺癌细胞MCF-7由G1期进入S期的进程明显被阻滞了,结果完成一个细胞周期所需的时间延长,导致细胞的增殖能力下降。8.2实时荧光定量PCR方法检测INHA干扰细胞系中周期蛋白cyclinA, cyclinB,cyclin D1的表达情况显示扰INHA能明显下调CyclinA、B、D1、的mRNA水平,特别是CyclinD1口B。结论：INHA基因在乳腺癌组织中,两株抗体的染色均呈表达下降趋势。在乳腺相关疾病中,不同种类的乳腺癌细胞表达不一致,呈现出良性细胞表达强而恶性表达弱。但是在肉瘤组织中,N端抗体和C端抗体的表达不一致,C端抗体染色表达明显上升,表达强度接近良性组织,显示INHA的不同剪切形式可能在不同类型组织中表现不同。过表达或干扰INHA基因均可以抑制乳腺癌细胞的增殖和细胞周期的进程,这提示INHA基因是一个很复杂的基因,其在不同的细胞类型发挥的功能可能不一致。然而,我们仍然初步证实INHA基因可以通过抑制cyclin的表达,延缓细胞周期的进程,为更深入的机制研究奠定了良好基础。