自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解胞浆中受损或废弃的细胞器及不再需要的大分子物质的过程。自噬过程中形成的双层膜结构的囊泡称为自噬小体(autophagosome)。自噬对细胞的能量循环、代谢、细胞器的更新及维持细胞内稳态有非常重要的作用。研究表明，许多肿瘤细胞都存在自噬活性的改变，细胞自噬与肿瘤的发生、发展及治疗之间存在着重要的相关性。通过诱导自噬及抑制溶酶体/蛋白酶体的活性，细胞内大量的长寿蛋白、短寿蛋白、核糖体错误编码的产物(DRiPs)包裹在自噬小体中。这种的自噬小体被称为DRibbles(DRiPs-containing blebs)。研究发现，DRibbles中包含了多种损伤相关分子模式(DAMPs)分子，包括热休克蛋白(HSPs)、钙网蛋白(calreticulin)以及高迁移率族蛋白1(HMGB1)等。DRibbles中包含的这些的模式分子可以作为天然佐剂在免疫应答过程中发挥重要作用。已经证明，DRibbles是“交叉递呈”肿瘤抗原的有效载体，树突细胞(DCs)能通过细胞质膜微囊及网格蛋白介导的方式将DRibbles中所含的肿瘤抗原交叉递呈给T细胞，进而诱导抗肿瘤免疫应答。　　B细胞最重要的功能是分化为浆细胞分泌抗体并介导体液免疫应答。抗体通过诱导保护性的抗体应答可作为机体抗感染的第一道屏障。B细胞能通过BCR特异性的识别可溶性抗原和细胞膜相关抗原，并产生应答。新近研究证明，B细胞表达几乎所有亚型的TLRs，能够识别病原相关的分子模式(PAMPs)，在B细胞增殖、分化、细胞因子和抗体分泌等方面起调节作用，被称为B细胞活化的第三信号。B细胞除了可在体液免疫中发挥重要作用外，还可以作为专职的抗原递呈细胞，在特定条件下可以有效地交叉递呈抗原。然而，静息的B细胞不能激活初始T细胞(Na(i)ve T cells)，反而会使它失活。有研究采用脂多糖(LPS)等刺激活化B细胞可以上调B细胞表面MHCⅠ类、Ⅱ类分子以及共刺激分子CD80/86等，但依旧无法有效活化初始T细胞，尤其是初始CD8+T细胞。有研究证明，联合CD40分子（转染CD40L的3T3细胞、可溶性的CD40L三聚体、抗CD40抗体等）、细胞因子IL-4及TLR激活剂(LPS、CpG等)，可在体外活化外周血来源的B细胞，上调其表面MHCⅠ类和Ⅱ类分子以及共刺激分子CD80/86的表达，诱导B细胞大量增殖。并且活化的B细胞负载抗原（肿瘤细胞裂解液、短肽、逆转录病毒/RNA转染抗原或病毒抗原等）后，在体外能诱导抗原特异性的初始CD8+T细胞及CD4+T细胞免疫应答。许多研究也证明，活化的B细胞可以诱导抗原特异性的T细胞应答进而具有抗肿瘤效应。我们的前期实验中，发现肿瘤细胞自噬小体DRibbles能诱导B细胞增殖、活化并分泌肿瘤抗原特异性抗体，但自噬小体活化B细胞的分子机制及其抗肿瘤作用尚不清楚。　　目的:　　研究肿瘤来源自噬小体(DRibbles)活化B细胞分子机制;研究B细胞交叉递呈DRibbles抗原诱导T细胞应答及其抗肿瘤作用的效果及其免疫学机制。　　方法:　　1.用DRibbles刺激野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠脾脏B细胞，检测TLRs在DRibbles诱导的B细胞活化中的作用。DRibbles与小鼠脾脏B细胞孵育不同时间(0、20、40、60min)，western blot法分析NF-kB通路中I-kBα和IKKα/β的磷酸化水平，探讨DRibbles活化小鼠B细胞的信号通路。采用HMGB1抗体封闭DRibbles中的HMGB1抗原表位，然后与磁珠分选的小鼠脾脏B细胞共孵育，检测B细胞MHCⅡ类分子与CD86的表达以及培养上清中IL-6、IL-10和总IgM含量，探讨HMGB1对DRibbles刺激B细胞活化的影响。采用FilipinⅢ封闭B细胞中caveolae介导的细胞内吞，然后与DRibbles共孵育，检测caveolae介导的细胞内吞对DRibbles刺激B细胞活化的作用。　　2.采用DRibbles(OVA+)免疫OT-1小鼠的淋巴结细胞作为效应T细胞，体外与单独DRibbles、单独B细胞、负载DRibbles或肿瘤细胞裂解液的小鼠B细胞共孵育5天，单独的培养基和OT-1 peptide SIINFEKL分别作为阴性和阳性对照。采用流式细胞术检测CFSE标记的OT-1效应T细胞的增殖。分选DRibbles免疫小鼠的效应CD4+T和CD8+T细胞，与负载DRibbles的野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠B细胞分别孵育72h，ELISA及胞内染色法检测细胞分泌IFN-γ的含量;分选DRibbles免疫小鼠的效应CD4+T和CD8+T细胞，与负载αHMGB1封闭DRibbles的B细胞共孵育，ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的含量，探讨DRibbles抗原刺激效应 T细胞再活化的物质基础;分选DRibbles免疫小鼠的效应CD4+T和CD8+T细胞，与负载DRibbles的野生型及FilipinⅢ处理的B细胞分别孵育72h，ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的含量，探讨B细胞交叉递呈DRibbles抗原、诱导效应T细胞再活化的分子机制。　　3.皮下接种小鼠T淋巴瘤细胞—EG7构建小鼠淋巴瘤模型，第7天采用淋巴结注射DRibbles(OVA+)作为首次免疫同时伴随或不伴随OT-1 T细胞的尾静脉回输，第10，14天以尾静脉注射以CpG、抗CD40抗体预处理或不处理的B/DRibbles(OVA+)疫苗、DC/DRibbles方式进行加强免疫，并以单独B细胞及未免疫组作为对照，定期测量检测实体瘤大小以观察B/DRibbles疫苗在抗肿瘤效应中的作用;收获上述小鼠的肿瘤组织、脾脏组织以及血清，采用流式细胞仪检测肿瘤组织浸润CD4+T和CD8+T细胞的比例、脾脏细胞中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T细胞的比例;采用ELISA检测血清中抗EG7肿瘤抗原特异性抗体的水平，探讨B/DRibbles疫苗能否增强DRs疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用。　　4.采用OT-1小鼠的淋巴结细胞作为初始T细胞，体外与单独DRibbles(OVA+)、单独B细胞、负载DRibbles(OVA+)或肿瘤细胞裂解液的小鼠B细胞共孵育5天，单独的培养基和OT-1 peptide SIINFEKL分别作为阴性和阳性对照。采用流式细胞术检测CFSE标记的OT-1初始T细胞的增殖。B/DRibbles(OVA+)疫苗首次免疫并同时伴随OT-1 T细胞的尾静脉回输，3，6天后尾静脉注射B/DRibbles(OVA+)疫苗进行加强免疫，并以单独B细胞及未免疫组作为对照，第10天收获上述小鼠脾脏即淋巴结组织，采用流式细胞仪检测体内OT-1 T细胞的增殖。皮下接种小鼠T淋巴瘤细胞—EG7构建小鼠淋巴瘤模型，第7天采用淋巴结注射以CpG、抗CD40抗体预处理或不处理的B/DRibbles(OVA+)疫苗作为首次免疫同时伴随或不伴随OT-1 T细胞的尾静脉回输，第10，14天以尾静脉注射以CpG、抗CD40抗体预处理或不处理的B/DRibbles(OVA+)疫苗、DC/DRibbles(OVA+)方式进行加强免疫，并以单独B细胞及未免疫组作为对照，定期测量检测实体瘤大小以观察B/DRibbles(OVA+)疫苗在抗肿瘤效应中的作用;收获上述小鼠的肿瘤组织、脾脏组织以及血清，采用流式细胞术检测肿瘤组织浸润CD4+T和CD8+T细胞的比例、脾脏细胞中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T细胞的比例;采用ELISA检测血清中抗EG7肿瘤抗原特异性抗体的水平，探讨负载B/DRibbles(OVA+)疫苗能否诱导初始T细胞应答及其抗肿瘤作用。　　结果:　　1.与正常小鼠及TLR4-/-小鼠相比，DRibbles不能上调TLR2-/-、MYD88-/-敲除小鼠B细胞表面MHCⅡ类分子、共刺激分子CD86的表达，IL-6、IL-10和总IgM水平也明显降低。DRibbles与小鼠脾脏B细胞孵育后能引起下游NF-kB信号通路中I-kBα及IKKα/β的磷酸化。HMGB1抗体封闭DRibbles刺激B细胞表面MHCⅡ类分子及CD86的表达的上调作用显著低于未封闭DRibbles及同型对照抗体封闭DRibbles组，HMGB1抗体封闭DRibbles刺激B细胞产生IL-6、IL-10和总IgM水平也明显低于未封闭DRibbles及同型对照抗体封闭DRibbles组。DRibbles刺激FilipinⅢ封闭的B细胞表面MHCⅡ类分子及CD86的表达的上调作用显著低于未封闭B细胞组，产生IL-6、IL-10和总IgM水平也明显低于未封闭组。　　2.体外负载DRibbles(OVA+)的B细胞能交叉递呈DRibbles(OVA+)抗原诱导OT-1效应T细胞的增殖明显高于单独DRibbles组、单独B细胞组及B细胞负载肿瘤细胞裂解液组。与正常小鼠及TLR4-/-小鼠相比，TLR2-/-、MYD88-/-敲除小鼠B细胞摄取DRibbles刺激特异性效应CD8+T和CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平显著降低。B细胞摄取HMGB1抗体封闭的DRibbles刺激特异性效应CD8+T和CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平明显低于未封闭DRibbles及同型对照抗体封闭DRibbles组。FilipinⅢ处理的B细胞摄取DRibbles刺激特异性效应CD8+T和CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平亦明显低于未封闭B细胞组。　　3.在C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型中，B/DRibbles(OVA+)疫苗加强免疫能增强DRs疫苗诱导的免疫应答，过继转移OT-1细胞，肿瘤消除，小鼠可以正常生存;若不过继OT-1细胞，可显著抑制小鼠EG7模型的肿瘤生长，小鼠生存时间延长;B/DRibbles疫苗加强免疫荷瘤小鼠后，能诱导有效的效应T细胞应答，能显著提高肿瘤组织中浸润CD4+T和CD8+T细胞的比例。同时发现，B/DRibbles疫苗加强免疫能诱导产生较高的肿瘤抗原特异性抗体IgM、IgG。联合应用CpG和抗CD40抗体优化的B/DRibbles疫苗进行三次免疫后，肿瘤消除，小鼠得以正常生存，并能引发高水平的效应T细胞应答。　　4.体外负载DRibbles(OVA+)的B细胞能交叉递呈DRibbles抗原诱导OT-1初始T细胞的增殖明显高于单独DRibbles组、单独B细胞组及B细胞负载肿瘤细胞裂解液组。B/DRibbles(OVA+)疫苗能在体内交叉递呈DRibbles抗原活化初始OT-1 T细胞。在C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型中，过继转移OT-1细胞，肿瘤消除，小鼠可以正常生存;若不过继OT-1细胞，可显著抑制小鼠EG7模型的肿瘤生长，小鼠生存时间延长;B/DRibbles疫苗免疫荷瘤小鼠后，能诱导有效的效应T细胞应答，能显著提高肿瘤组织中浸润CD4+T和CD8+T细胞的比例。同时发现，B/DRibbles疫苗免疫能诱导产生较高的肿瘤抗原特异性抗体IgM、IgG。联合应用CpG和抗CD40抗体优化的B/DRibbles疫苗进行三次免疫后，能引发高水平的效应T细胞应答，可以增强抗肿瘤效果，但依然没有使肿瘤消退，需要进一步优化条件。　　结论:　　1.DRibbles活化B细胞依赖TLR2-MyD88-NF-κB信号通路。DRibbles所含内源性危险信号分子HMGB1与B细胞的活化有密切关系。Caveolae(细胞质膜微囊)介导的细胞内吞作用(endocytosis)与DRibbles诱导B细胞活化有密切关系。　　2.B细胞能有效交叉递呈DRibbles抗原并刺激效应CD4+T和CD8+T细胞的再活化及分泌IFN-γ，该作用依赖B细胞的TLR2/MyD88信号通路。DRibbles所含内源性危险信号分子HMGB1与B细胞交叉递呈DRibbles刺激效应CD4+T和CD8+T细胞的再活化有密切关系。Caveolae(细胞质膜微囊)介导的细胞内吞(endocytosis)与B细胞交叉递呈DRibbles抗原并刺激效应CD4+T和CD8+T细胞再活化有密切关系。　　3.B/DRibbles加强免疫能增强DRibbles疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用;联合应用CpG和抗CD40抗体能有效加强B/DRibbles疫苗的抗肿瘤作用。　　4.B/DRibbles首次免疫能诱导抗原特异性初始T细胞免疫应答及抗肿瘤作用;联合CpG和抗CD40抗体能加强B/DRibbles疫苗的抗肿瘤作用。