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前言 最近人们发现某些抗肿瘤药物除了具有细胞毒性作用外，可能还有放射增敏作用。由于抗肿瘤药物作为放射增敏剂在临床应用时，有其它药物不可比拟的优越性，因此受到肿瘤放射治疗界的广泛重视。目前作用于微管的紫杉类新型抗肿瘤药物较多，其中对泰素放射增敏作用的研究较多，而且各家的报道差异很大，有关多西紫杉醇放射增敏作用的研究报道较少见。本实验采用细胞集落形成方法来研究多西紫杉醇对鼻咽癌细胞系CNE-Ⅰ有无放射增敏作用及其放射增敏作用与其作用时间和浓度的相关性，从而为今后临床使用多西紫杉醇作为放射增敏剂提供理论依据。 实验材料 1、细胞系：人鼻咽癌细胞系CNE-Ⅰ，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。 2、药物：多西紫杉醇(TAXOTERE)，由AVENTIS公司馈赠，冷藏保存。实验前将药物用PRMI1640培养液配制成所需的浓度。 3、主要试剂：PRMI1640培养液，内含10％新生小牛血清。胰酶，PBS液。 4、主要仪器：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、微量加样器和血球计数器由中国医科大学细胞生物实验室提供。PRIMUS直线加速器由中国医科大学放疗科提供。6cm塑料平皿，由华美生物制品有限公司提供。 实验方法 将人鼻咽癌细胞系 CNE｛置于 37T，5％CO。培养箱内，用含10％新生小牛血清的PRMll640培养液在培养瓶内单层传代培养，取指数生长期细胞进行实验。 实验分组： 阴性对照组：培养皿内只接种瘤细胞，不做任何处理； 阳性对照组：即单纯用药组，采用不同浓度的药物作用不同的时间； 单纯放射组：分别照射 1．3j＊s； 多西紫杉醇加照射组：不同浓度药物作用不同时间后，立即除去药物，然后照射l3j＊J。 每平皿内接种细胞数因药物浓度、药物作用时间、照射剂量不同而不同，接种细胞数要使形成的集落数达到100－－－－00个为宜。 实验步骤： 门）多西紫杉醇药物毒性测定 取处于指数生长期的CNEJ细胞，胰酶消化计数，将细胞接种于6cm平皿中，每平皿接种400个细胞，贴壁培养12 ／J＼时后，吸出培养液，分别加人用PRMll640培养液配制好的多西紫杉醇，浓度媚u为 2 x 10－‘mg／Inl、lx10－‘…rnl、5 x 10－’mg／rnl、Zx 10－bg／Inl、lx 10－’mgilnl、5 x 10－‘mg／ml、2 x 10－‘mg／Inl，每个浓度设 2个平行样。药物作用3小时后，立即除去药物，并用PBS液洗涤细胞二次，重新加人不含药物的新鲜培养液SInl，置于培养箱中培养14天，固定染色后计数细胞集落数，计算出集落形成率。实验重复2次，取2次平均值，以多西紫杉醇药物浓度负对数为模坐标，以存活率为纵坐标，绘出多西紫杉醇的剂量－效应曲线，推算出多西紫杉醇的 ID35、ID50、ID70和 ID90。 ·2· p）不同浓度多西紫杉醇作用相同时间对 CNEI细胞放射敏感性的影响 以高于ID50的lx 10－‘mg／ml（ID90），2 x 10－’mgllnl（ID70）和低于ID50的 IX 10一仰4rnl（ID3）的药物浓度作放射增敏研究。将培养瓶内指数生长期的CNE｛细胞胰酶消化，计数活细胞数，逐级稀释后将细胞接种6cm平M中，贴壁培养12 ／J＼时。吸出培养液，用药组分别加人含有不同浓度多西紫杉醇厂 10－Vg／ml，2 x 10－bg／Inl，lx 10－＼g／Inl）的培养液 SInl，单纯照射组只加人不含药物培养液srnl，继续培养3小时后立即除去药物，并用PBS液洗涤细胞两次，加人不含药物培养液srnl。然后单纯照射组和药物加照射组用剂量率 200cGy／min，SSD100cm 6MV X线分别照射1乃5 P。照射后在37℃，5％CO。培养箱内继续培养14天。 O）同一浓度多西紫杉醇作用不同时间对CNE｛细胞放射敏感性的影响 以 2 x 10刁m矿d多西紫杉醇进行实验。用药组加人含有 2x 10－b砂d多西紫杉醇培养液分别继续培养 3在、24 ／J’时，余处理方法同上。 培养14天后，细胞用95％乙醇固定后，0．25％结晶紫染色，并计数集落数（计数含有250个细胞的集落入计算细胞存活率瞩F八存活率＝照射后细胞形成的集落创（接种细胞数X未照射细胞集落形成数人 采用SPSSS．0和Origin统计软件根据各照射剂量点的存活率绘制细胞存活曲线，由细胞存活曲线计算出多西紫杉醇在10％存活率水平时的放射增敏比（SER人SER的定义为在达到相同生物效应时单纯照射组的剂量与药物加照射组的剂量之比。 ·3· 实验结果 根据多西紫杉醇的药物剂量－效应曲线，推算多西紫杉醇的ID35为 lx 10－‘mgllnl，ID50为 3．2 x 10－‘m才rnl，ID70为 2 x10－bg／ml，ID90为 IX 10－＼。从实验结果看，多西紫杉醇对CNE－I细胞有较强的细胞毒性作用，随药物浓度的增加，细胞的存活率降低。根据细胞存活曲线测得在10％细胞存活水平时，不同浓度的多西紫杉醇（二 X10－‘、2 X10－’＼1 X10－‘＊g／d）作用3 ／J＼