1研究背景和目的食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,显著的地域性分布差异是食管癌突出的流行病学特征之一,高低发区可相差500倍左右。河南林县地区是世界上食管癌发病率最高的地区,贲门癌在该地区发病率亦很高,食管癌和贲门癌是并发的疾病。同一个体同时或先后发生食管/贲门双原发癌(简称双源癌,concurrent cancers from esophagus and gastric cardia, CC)并非罕见。食管贲门双源癌发生在同一个体,遗传背景和环境因素相似,为研究食管癌和贲门癌发病机制差异及其想换关系的一种理想模型,对其进行深入研究有助于解食管癌的发病特点和分子机制。双源癌患者的同一个体,基因和外界环境影响完全相同,并具有相同的遗传表型,与单一的食管癌和贲门癌相比,对阐述遗传因素,特别是表观遗传(甲基化)对食管癌发生的遗传具有重要意义。DNA甲基化是环境因素对DNA造成的一种损伤,为一种表观遗传修饰,指在DNA甲基转移酶的作用下将甲基添加在DNA分子中的碱基上。通常所说的DNA甲基化多指由DNA胞嘧啶C-5甲基转移酶识别5’-CG-3’序列(CpG),把S腺苷甲硫酸(SAM)的甲基转移到胞嘧啶的5位,生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。在结构基因的5’端调控区段,CpG二联核苷常常以成簇串联的形式排列,这种富含CpG二联核苷的区域称作CpG岛,其大小为500～1000bp,约56%的编码基因含有该结构。DNA甲基化可以影响基因的表达,为基因失活的原因之一,肿瘤发生时基因的甲基化可以高表达也可以局部低表达,研究表明基因启动子的高甲基化和相应基因表达的缺失,是人类癌症的重要分子标志,DNA甲基化和许多癌症及疾病相关。目前基因甲基化整体分析集中在正常和肿瘤细胞DNA的CpG甲基化位点的分析比较上本实验室已有一系列关于双源癌的研究报道,对双源癌临床病理特征和预后影响因素进行了初步探讨。本研究进一步扩大双源癌患者例数,在实验室原有的工作基础上进一步比较双源癌患者和单发食管/贲门癌患者的临床病理、家族史及生存期关系,针对流行病理特征及其预后进行分析,为临床评价和肿瘤早期预防提供流行病学依据。本研究还对双源癌患者的基因甲基化结果进行分析,探讨双源癌发生过程的分子改变,为食管/贲门双源患者临床治疗提供分子靶向指标。2材料与方法2.1研究对象2.1.1资料来源采用家访和问卷调查、住院病理核查以及电话随访等方法,收集整理河南、河北、山西三省交界食管癌高发区的双源癌1,011例患者的临床病理资料,2,095例单发食管癌和1,859例单发贲门癌患者的临床病理资料。其中有随访结果的分别是263例,796例和252例。2.1.2甲基化实验1例食管癌和贲门癌的双源癌患者来自食管癌高发区,经组织病理学检查确诊为双源癌,手术切除取得食管和贲门部位组织并抽取3ml抗凝血。2.2研究方法2.2.1临床随访在食管癌高发区采用入户问卷调查的方法收集到食管癌、贲门癌、双源癌患者的基本信息,包括姓名、年龄、职业、籍贯、发病时间、患病类型、治疗医院、治疗时间、家族史、联系方式等,去医院病理科或档案室核实患者的患病类型和临床分期、治疗情况等信息,采用电话随访的方式得到病人的生存状况,计算出生存期。2.2.2甲基化芯片杂交用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒按照产品操作说明书提取样本基因组DNA。采用北京怡美通德公司Human Methylation450K芯片检测1例双源癌患者血样食管、贲门癌组织DNA的甲基化改变,包括变性、断裂、沉淀、重悬、杂交、洗涤、延伸和扫描等过程。2.3统计学分析2.3.1临床资料数据分析采用SPSS17.0统计软件包进行数据统计,t检验、x2检验、Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox模型等方法分析双源癌和单发食管/贲门癌患者临床病理特征和生存期。检验标准为a<0.05。2.3.2甲基化数据分析通过芯片图像分析软件对芯片灰度扫描图进行分析,可以得到一些参数值,包括芯片上每个CpG点上无甲基化和无甲基化探针的信号强度,CpG点的甲基化水平值以及检测P值等。3结果3.1双源癌和单发食管/贲门癌患者家族史分析双源癌家族史阳性率比单发贲门癌家族史阳性率高(34%vs.27%,P<0.05),与单发食管癌相似(34%vs.31%,P>0.05)3.2双源癌和单发食管/贲门癌患者临床病理分析双源癌中食管癌和贲门癌早期患者多于单发食管癌(27%vs.15%)和单发贲门癌患者(18%vs.4%,P<0.05)。3.3双源癌和单发食管/贲门癌患者生存期分析双源癌患者生存率低于单发食管癌和单发责门癌患者(P<0.05),进一步用COX回归分析校正年龄和早中晚分期因素,双源癌患者死亡风险分别为单发食管癌和单发贲门癌患者的2倍(P<0.05,HR=1.976)和3倍(P<0.05,HR=2.652)。3.4双源癌患者中临床分期、分化程度和大体形态分析3.4.1双源癌患者中食管癌和贲门癌同时为早期的患者24例(8%),同时为中晚期的患者164例(56%)。单一早期食管癌和中晚期贲门癌的患者64例(22%),反之,单一早期贲门癌和中晚期食管癌的患者43例(14%)3.4.2双源癌中食管癌和贲门癌分化程度均以中分化为主；大体形态方面,食管癌以髓质型(37%)和溃疡型(26%)为主,贲门癌以溃疡型(48%)和浸润型(15%)为主。3.5食管癌患者DNA甲基化分析结果甲基化分析结果显示食管癌组织DNA单独具有的CpG位点数位为1276；贲门癌组织DNA单独具有的CpG位点数位为1608。4结论4.1双源癌患者家族史阳性率高于单发贲门癌患者,双源癌患者遗传易感性高于单发贲门癌患者,双源癌为同一个体身上同时或先后发生的食管癌和责门癌,遗传易感性较单发肿瘤高。4.2双源癌中食管癌和贲门癌早期患者均多于单发食管癌和单发贲门癌患者。4.3双源癌患者生存率低于单发食管和贲门癌患者,提示临床中早期发现双源癌患者,提高患者预后。4.4双源癌患者中食管癌和贲门癌临床分期一致的占64%,不一致的占36%；分化程度方面,两者均以中分化为主；大体型态方面,食管癌以髓质型和溃疡型为主,贲门癌以溃疡型和浸润型居多。