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目的探讨lncRNAs在Twist诱导的EMT化乳癌细胞中促肿瘤干细胞的富集及干性维持的作用和分子病理机制。方法(1)逆转录病毒感染法构建Twist基因稳定表达的MCF-7/Twist人上皮样乳癌细胞,Western blotting、细胞免疫荧光法检测EMT标志蛋白的表达。(2) mammospheres形成实验检测MCF-7/Twist细胞和MCF-7/Vector细胞mammosphere形成能力,qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光实验检测富集得到的mammospheres中Twist及CSC标记物的表达情况；mammospheres连续传代实验、细胞计数和transwell迁移实验检测肿瘤干细胞自我更新能力、增殖能力和迁移能力。(3)应用人Agilent lncRNA芯片检测MCF-7/Vector细胞和MCF-7/Twist细胞来源的CSC样细胞中lncRNAs的表达谱,qRT-PCR实验验证芯片结果。(4)生物信息学方法分析MCF-7/Twist细胞来源的CSC样细胞异常lncRNAs的靶向mRNAs,结合mRNAs芯片数据,分析异常的信号通路,Western blot验证相关信号通路活化情况。(5)在Twist阳性的乳腺癌细胞株Hs578T和BT549中,特异靶向敲除Twist基因、特异抑制剂GDC-0449阻断Hedgehog信号通路检测细胞的mammosphere形成能力、CSC标记物的表达情况和Hedgehog信号通路关键信号分子GLI 1的活化情况。(6)生物信息学及定量PCR方法确定Hedgehog信号通路特异相关lncRNA(lncRNA-Hh)。(7) qRT-PCR方法检测lncRNA-Hh与转录因子Twist的关系,荧光素酶报告实验检测lncRNA-Hh的转录活性。(8)慢病毒感染法构建稳定表达lncRNA-Hh的MCF-7细胞株、特异靶向干扰lncRNA-Hh的Hs578T, Hs578T乳腺癌细胞株,检测细胞的mammosphere形成情况、CSC标记物(SOX2,OCT4)的表达情况、Hedgehog信号通路关键信号分子GLI1的活化和lncRNA-Hh靶基因蛋白GAS1的表达。(9)裸鼠皮下成瘤模型明确lncRNA-Hh是否促进乳腺癌细胞的体内成瘤,qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学染色实验检测GAS1、SOX2、GLI1和OCT4在瘤体组织中的表达。结果(1)转录调控因子Twist成功诱导上皮样乳癌细胞MCF-7发生EMT转化。(2)EMT化的MCF-7细胞促进肿瘤干细胞样细胞的富集,mammosphere小球数量多、体积大,且具有更强的自我更新、增殖和迁移能力。(3)lncRNAs芯片结果显示有462个异常表达的lncRNAs(差异倍数5倍以上),其中有270个上调的lncRNAs和172个下调的lncRNAs,2065个异常表达的mRNAs(差异倍数1.5倍以上)。生物信息学方法分析显示462个异常表达的lncRNAs(差异倍数5倍以上)预测得到的靶基因有797个。(4)信号通路富集度分析结果显示,Hedgehog、Wnt、MAPK、TGF-β和Notch等与肿瘤干细胞相关的经典信号通路被异常活化。P-value值最高的Hedgehog信号通路中的关键信号分子sHh和GLI1的活化明显增强。(5)特异靶向敲除Twist基因或特异抑制剂GDC-0449阻断Hedgehog信号通路,减弱mammosphere形成、CSC标记物的表达下调和GLI1的活化减弱。(6)生物信息学及qRT-PCR方法确定了Hedgehog信号通路特异相关lncRNA为lncRNA (chr9,89563614-89616948,+)(命名为lncRNA-Hh)。(7) qRT-PCR方法和荧光素酶报告实验显示Hedgehog信号通路特异相关lncRNA-Hh受转录因子Twist的调控。(8) lncRNA-Hh促进Twist阳性乳腺癌细胞mammosphere形成、CSC标记物(SOX2,OCT4)的表达、GLI1的活化和靶基因蛋白GAS1的表达。(9)lncRNA-Hh促进乳腺癌细胞CSC样细胞的体内成瘤,促进GAS1、SOX2、GLI1和OCT4在瘤体组织中的表达。结论在Twist诱导的EMT转化和Twist阳性的乳腺上皮细胞中lncRNA(如lncRNA-Hh)作为重要的新型调控因子参与调控CSC相关信号通路(如Hedgehog信号通路)的活化,从而促进CSC富集、自我更新和体内成瘤。