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目的:2014年广东/广州登革热大暴发流行,其中广州病例37354例,白纹伊蚊是广州地区唯一重要登革热传病蚊媒,但未能检出广州野生白纹伊蚊种群中的登革病毒(DENV),本研究旨在构建自现场采集至实验室检测全程优化的白纹伊蚊野外种群携带登革病毒的检测体系。方法:1根据NCBI收录DENV全长,结合本实验室自2014年广州DENV患者分离病毒株序列,并对DENV患者血浆及其分离获得病毒的C6/36细胞病毒悬液进行RNA-seq的高通量测序结果深入分析,设计针对DENV不同区域通用型和型别特异性PCR、nest-PCR和q RT-PCR的系列引物与探针。以C6/36细胞富集DENV制备病毒悬液,Trizol提取总RNA,特异性引物逆转录c DNA后,梯度稀释进行PCR,nest-PCR和q RT-PCR的检测极限测试和各体系的比较与优化。2制备含DENV检测目标片段的标准质粒,测序验证后,用以梯度稀释测试获得检测极限值(LOD)3以DENV病毒悬液制备血餐喂饲白纹伊蚊,取饱血蚊进行不同保存方法(保存时间、温度,是否100%乙醇浸泡)的DENV PCR检测。4以优化的保存及检测方案进行2015广州新发本地病例疫情点周边白纹伊蚊幼虫和成蚊携带DENV检测。5 PCR阳性片段进行克隆测序及生物信息学分析。结果:筛查获得NCBI收录1967条DENV全长,其中中国大陆70条。本实验室分离DENV株RNA-seq显示各片段在患者血浆以及C6/36病毒悬液中的Reads数量存在2-5倍差异,3’UTR等区域RNA拷贝数高。因而用作白纹伊蚊野外种群携带病毒筛查用的通用型PCR、nest-PCR和q RT-PCR选定在3’UTR区,在pr M、NS5等区域设计经初筛阳性后的标本验证体系。成功构建检测靶标片段的标准质粒。保存方法以活成蚊和幼虫,或采用100%乙醇浸泡,-20℃冻存为佳。所建立的检测体系能敏感、特异地自病毒悬液和实验室感染蚊中检出病毒片段,自DENV疫情点白纹伊蚊幼虫标本中检出7份阳性(5只白纹伊蚊幼虫/份,7/43),经克隆后双向测序,为预期的DENV3’UTR区175bp序列,为DENVI型,分析与本实验室DENVI型分离株及国际标准夏威夷株(DENV-I,Hawaii)同源性92-98%。结论:构建并优化白纹伊蚊野生种群DENV保存运输至实验室测试的体系,可敏感特异性地检出白纹伊蚊携带病毒情况。