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目的乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)作为关键调节因子可介导肝细胞脂质蓄积过程,其中胆固醇转运功能障碍引起的游离胆固醇(FC)增加与HBx所致脂质蓄积有关。小窝蛋白1(CAV1)存在于线粒体相关性内质网膜(MAM)中,参与胆固醇转运;本研究旨在探讨CAV1作为MAM组分调控胆固醇转运功能在HBx诱导肝细胞脂毒性中的作用。方法利用GEO数据库分析NASH患者肝组织中胆固醇转运和合成相关基因CAV1和SREBF2的相对表达情况。采用人肝癌HepG2细胞、HBV基因组稳定复制的HepG2.2.15细胞和带有Teton开关的HepG2-Tet-ON-HBx细胞,以及构建CAV1稳定高表达HepG2-CAV1细胞进行体外试验。如下处理建立模型:HepG2细胞瞬转pcDNA3.1-HBx质粒、HepG2-Tet-ONHBx细胞给予DOX(1μg/mL)处理48 h诱导HBx表达;HepG2.2.15细胞瞬转anti-HBx表达质粒干预HBx表达。qRT-PCR检测细胞中脂代谢相关基因mRNA水平,差速超速离心法提取MAM组分经WB检测COX-2和CAV1蛋白表达,邻位连接试验(PLA)观察位置邻近、以及免疫共沉淀(IP)检测蛋白的相互作用,免疫荧光(IF)实验观察CAV1与MAM(以红色MitoTracker和绿色ERTracker共定位表征)共定位、脂滴分布和FC分布,试剂盒检测细胞内TC、TG及FC水平。结果 GEO数据库(GSE89632)分析发现,与正常对照(n=24)相比,NASH患者(n=19)肝组织样本中基因表达水平在CAV1明显降低、SREBF2显著升高、且二者具有显著负相关性(均P<0.05),提示NASH病人肝组织中CAV1与胆固醇代谢的潜在关联性。体外试验中,与对照组细胞相比,①HBx表达的HepG2-Tet-ON-HBx细胞中CAV1 mRNA水平降低,CAV1蛋白水平在HBV/HBx表达的HepG2细胞中降低、anti-HBx处理组细胞中增加,提示HBx表达肝细胞中CAV1表达受抑制;②HBx表达的HepG2-Tet-ON-HBx细胞中,PLA实验观察到COX-2与CAV1红色荧光焦点数量增多,提示二者空间位置邻近效应增加,且IP结果显示二者互作增强;③HBx表达的HepG2-Tet-ON-HBx细胞MAM组分中CAV1蛋白减少、COX-2蛋白水平增加,IF实验观察到CAV1与MAM的共定位(即白色荧光焦点)减少,而FC与MAM的共定位(即白色荧光焦点)增加,提示HBx表达可抑制MAM上CAV1的胆固醇转运功能,诱导mito-ER中胆固醇聚集和引发细胞中TC、TG及脂滴增加;④与HepG2-pB细胞相比,HBx转染的HepG2-CAV1细胞中TC、TG和脂滴及FC水平降低,提示CAV1参与HBx表达肝细胞中脂质代谢的调节作用。结论 HBx表达参与HBV感染肝细胞中COX-2和CAV1互作的调节,经由降低MAM上CAV1组分的分布抑制MAM中胆固醇转运过程,介导FC依赖性肝细胞中脂质蓄积;提示靶向MAM中CAV1-COX-2复合物形成和分布的干预,可为HBV/HBx相关肝细胞脂质代谢调节提供潜在靶点;同时为探明外源因素(如HBx等)暴露经由脂质代谢途径(如胆汁酸代谢)诱发肝脏脂毒性相关损伤和疾病的机制提供线索。