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咖啡因(1,3,7-三甲基黄嘌呤)是一种众所周知的嘌呤生物碱,常见于天然产物茶、咖啡、和可可中。大量研究表明,咖啡因对人体有提神减脂等多种药理作用。有研究报道,咖啡因在机体内具有抗氧化作用,而咖啡因的化学结构较稳定,在体外很难表现出抗氧化活性。那咖啡因在机体内究竟如何表现出抗氧化作用,其作用机制又如何?鉴于此,我们通过动物水平、细胞水平、分子水平三个层次对咖啡因的抗氧化作用机制进行了深入探讨。首先,我们以小鼠皮肤光老化为抗氧化模型,探讨了咖啡因的抗氧化作用与机理。将小鼠分为7组,分别是空白组、UV对照组、UV+CAF50μg/mL、UV+CAF100μg/mL、UV+CAF50μg/mL+3-TYP(16nM)、UV+CAF100μg/mL+3-TYP(16nM)、UV+3-TYP(16nM),(3-TYP为SIRT3特异性抑制剂),每日紫外照射前1h,对小鼠背部皮肤去毛,咖啡因涂抹处理7d后,皮肤取样,H&E染色和Masson染色。结果表明,咖啡因处理的小组紫外线暴露引起的角质层变厚明显减少,SOD2活性增强,紫外照射引起的皮肤损伤明显减弱。同时,50和100μg/mL的咖啡因可以降低SOD2的乙酰化水平,增强其活性,减少紫外线照射引起细胞内ROS的积累和凋亡。3-TYP与咖啡因共同处理后,紫外照射对皮肤的损伤无法恢复。其次,我们以HacaT(人表皮永生化角质细胞)为模型探讨咖啡因的抗氧化机制,照射前1h加入咖啡因进行预处理,克隆形成实验可以观察到咖啡因对细胞具有保护作用,且咖啡因的加入显著增强由于UV照射引起的SIRT3以及SOD2活性的降低,同时细胞内SOD2、p53的乙酰化水平,凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase3和MMP3的表达水平以及辐射引起的ROS的积累与对照相比都有明显减少。而3-TYP加入后,咖啡因的作用则消失。最后,我们进一步探讨了咖啡因抗氧化作用的具体分子机制,试验分成了4组:咖啡因与SIRT3组、NAD+与SIRT3组、p53-Ac与SIRT3组、p53-Ac组,检测了NAD+或咖啡因与SIRT3,以及NAD+、p53-Ac两者共存时咖啡因与SIRT3的亲和力,结果发现1μM的咖啡因和10μM p53-Ac可以与SIRT3直接结合,而NAD+不能直接与咖啡因结合,但NAD+或咖啡因存在时可以增强p53-Ac和SIRT3的亲和力,两者共存时p53-Ac和SIRT3的亲和力达到最强,为0.1μM。这表明咖啡因可能起类似于辅因子NAD+的作用。总之,由这些实验结果可知,咖啡因可以通过直接与SIRT3结合,表现出辅因子NAD+的类似功能,促进酶与乙酰化底物的结合,进一步激活SIRT3/SOD2/ROS而减轻氧化应激,从而表现出抗氧化作用,但关于咖啡因与SIRT3的结合部位仍不清楚,还需要更加深入的研究。本结果可为咖啡因的抗氧化机制提供了一定的理论依据,同时可为深入开发抗皮肤光老化功能产品及含咖啡因的天然产物的应用提供新思路。