2018年,美国癌症协会(ACS)发布的统计数据指出,在美国的肿瘤患者中,结肠癌(Colorectal cancer,CRC)发病率和病死率均位列第三。由于环境,饮食,生活方式的改变,我国的结肠癌近几年发病率和死亡率不断攀升。目前,结肠癌的诊治强调早期诊断和手术治疗,而结肠癌的诊断主要依赖肠镜等手段,大多患者确诊时已处于癌症中晚期,只能依赖放疗、化疗、姑息治疗等提高5年生存率,因此寻找特异的早期诊断新型生物标志物及分子治疗靶点有重要意义。Rap是一种小分子G蛋白,参与细胞的多种功能,Rap活性的失调与恶性肿瘤的发生发展有关。RaplGAP是Rap特异的GTP酶活化蛋白,能够使Rap从GTP结合形式失活转变成GDP形式,而甘丙肽受体(galanin receptor,GALR)能够激活Rap活性。作为调控Rap活性的Rap1GAP和GALR与肿瘤也会有密切关系。在正常-结肠腺瘤-结肠癌这一发展过程中Rap1GAP和GALR发挥的作用是未知的。粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)是一种在生长因子受体和整合素介导的信号中十分关键的调节因子,通过高度协调的信号网络调节致瘤和转移潜能来促进恶性肿瘤,这些信号网络协调各种细胞过程,如细胞存活,增殖,侵袭,上皮-间质转化等。细胞外信号激酶(Extracellular signal kinase,ERK)是丝裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)通路的主要成员之一,能够被多种生长因子和细胞因子磷酸化激活,主要调节细胞增殖和分化。因此调控FAK/ERK活性是癌症治疗的潜在靶标。目前尚不清楚在结肠癌中Rap1GAP能否通过抑制FAK/ERK通路发挥抗肿瘤作用。传统医学无肠癌一词,其症与“积聚“、“肠蕈”、“锁肛痔”等病接近,总病机为正虚邪实,肾藏精,为先天之本,古籍记载:“足于精者,百病不生,穷于精者,万邪蜂起”,肾气不足与肠癌的发生有紧密关系,中医在治疗肠癌时强调补肾法。淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)是常用的补肾药,淫羊藿苷(Icarrin,ICA)是植物淫羊藿中提取的异戊烯化黄酮醇苷,通过各种机制如诱导细胞凋亡,调节细胞周期,抑制血管生成,抑制转移对广泛肿瘤细胞有抑制作用,是用于治疗癌症的潜力药物。然而淫羊藿苷抑制结肠癌的机制并不清楚,其调控Rap1GAP的研究未见报道。基于此,我们以Rap1GAP为切入点,对淫羊藿苷干预结肠癌增殖和转移作用和机制进行了初步探讨。第一部分Rap1GAP和GALR在结肠腺瘤和结肠癌患者中的表达及临床意义目的:研究Rap1GAP和三种甘丙肽受体(GALR1、GALR2、GALR3)在结肠癌,结肠腺瘤和正常人组织和粪便中的表达,并分析其与大肠癌病理分型、分化程度等相关临床病理因素的关系。方法:收集石蜡包埋标本,结肠癌、结肠腺瘤各40例,正常结肠组织13例,收集粪便标本,结肠癌、结肠腺瘤各40例,健康人10例。采用qRT-PCR方法检测Rap1GAP和 GALR1、GALR2、GALR3 的表达。脾脏注射建立小鼠结肠癌肝转移膜型,成瘤后随机分为正常组、对照组(含0.5%生理盐水)、结果:大肠粘膜正常组织、腺瘤组织、大肠癌组织中Rap1GAP的表达量依次降低,差异有统计学意义(P<0.001)。在结肠腺瘤组织中,Rap1GAP的表达与性别、年龄、腺瘤大小无关;与腺瘤病理分型有关,绒毛状腺瘤低于管状腺瘤(P<0.05);与腺瘤分级有关,高级别瘤变低于低级别瘤变(P<0.05)。在结肠癌组织中,Rap1GAP的表达与性别、年龄无关、肿瘤大小无关;与肿瘤病理分型有关,在隆起型、溃疡型、浸润型组织中依次降低(P<0.05);与分化程度有关,在高分化、中分化、低分化组织中的依次降低(P<0.05);与肿瘤浸润深度有关,T1+T2期高于T3+T4期(P<0.05);与淋巴结转移有关,无淋巴结转移高于有淋巴转移(P<0.05);与远处转移有关,无远处转移高于远处转移(P<0.05)。健康人、腺瘤及大肠癌患者粪便中Rap1GAP的表达量依次降低,差异有统计学意义(P<0.001)。在结肠腺瘤患者粪便中,Rap1GAP的表达与性别、年龄、腺瘤大小无关;与腺瘤病理分型有关,绒毛状腺瘤低于管状腺瘤(P<0.05);与腺瘤分级有关,高级别瘤变低于低级别瘤变(P<0.05)。在结肠癌患者粪便中,Rap1GAP的表达与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤病理、分化程度无关;与肿瘤浸润深度有关,T1+T2期高于T3+T4期(P<0.05);与淋巴结转移有关,无淋巴结转移高于淋巴结转移(P<0.05);与远处转移有关,无远处转移组高于远处转移(P<0.05)。GALR1、GALR2、GALR3在正常结肠、结肠腺瘤、结肠癌组织中无显著变化(y>0.05)。GALR1、GALR2、GALR3在健康人、结肠腺瘤、结肠癌患者粪便中无显著变化(P>0.05)。结论:Rap1GAP的表达水平在正常结肠、结肠腺瘤、结肠癌中逐渐降低,说明其可能参与了结肠细胞的早期瘤变,并且在恶性肿瘤发生发展阶段发挥着抑癌基因的作用,具有一定的临床价值,为结肠癌的早期诊断提供了新的思路。第二部分淫羊藿苷抑制荷瘤鼠结肠癌的增殖和转移作用及机制目的:观察淫羊藿苷对裸鼠皮下移植瘤生长的影响,探讨淫羊藿苷对荷瘤鼠结肠癌生长的抑制作用;观察淫羊藿苷对结肠癌肝转移小鼠肝脏转移的影响,研究淫羊藿苷对荷瘤鼠结肠癌生长和转移的抑制作用。方法:将对数期的结肠癌HCT116细胞注射在裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤膜型,成瘤后随机分为正常组、对照组(含0.5%生理盐水)、淫羊藿苷低、中、高剂量组(40、80、160mg/kg),希罗达组(267mg/kg),灌胃给药。每天观察各组裸鼠的饮食、精神、活动情况,每3天称量体重并测量肿瘤的长短径,绘制体重和肿瘤大小曲线;治疗结束后,将所有裸鼠处死,取出肿瘤组织称量,比较各组的抑瘤率;Western blot检测肿瘤组织Rap1GAP、FAK、pFAK、ERK、pERK蛋白水平的变化。将对数期的结肠癌CT26细胞经脾脏注射建立小鼠结肠癌肝转移膜型,成瘤后随机分为正常组、对照组(含0.5%生理盐水)、淫羊藿苷低、中、高剂量组(40、80、160mg/kg),希罗达组(267mg/kg),灌胃给药。每天观察各组小鼠的饮食、精神、活动和腹部情况,治疗结束后,将所有小鼠处死,HE染色观察各组肝脏转移瘤组织形态,免疫组织化学染色比较各组小鼠肝脏肿瘤中的Rap1GAP和pFAK、pERK蛋白水平。结果:成功建立裸鼠皮下移植瘤和小鼠结肠癌肝转移膜型。在皮下移植瘤膜型治疗过程中未发现各组裸鼠饮食、精神、活动情况、体重有显著差异;处死后发现淫羊藿苷呈剂量依赖性抑制了移植瘤的体积和质量(P<0.05);淫羊藿苷治疗后,Rap1GAP蛋白上调,FAK和ERK蛋白不变,pFAK和pERK蛋白下调,且呈剂量依赖性。在结肠癌肝转移膜型中,淫羊藿苷组小鼠的饮食、精神、活动等情况均好于对照组;处死小鼠后,各组小鼠肝脏均发现转移瘤。与对照组相比,淫羊藿苷组体重、肝重、瘤重均较轻,瘤/肝重比较小,肺和腹膜转移较少,差异有统计学差异(P<0.05),该结果表明淫羊藿苷在体内能够抑制结肠癌肝转移,并且呈剂量依赖性;HE染色发现淫羊藿苷能够促进肿瘤组织坏死;免疫组化结果表明淫羊藿苷能够上调Rap1GAP,下调pFAK和pERK。结论:淫羊藿苷能够抑制荷瘤鼠的生长和转移,并且该作用可能与调控Rap1GAP和FAK/ERK活性有关。第三部分Rap1GAP调控FAK/ERK途径抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移目的:研究Rap1GAP对结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移的影响,探讨是否与FAK/ERK通路有关。方法:比较Rap1GAP在人正常结肠上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞HT29、HCT116,DLD1中的表达;构建慢病毒表达载体pLVPT-Rap1GAP(过表达Rap1GAP),三质粒系统病毒包装转染293T细胞,收集病毒上清感染HCT116细胞,培养阳性单克隆细胞株;构建PX459-sg-Rap1GAP质粒(敲除Rap1GAP),转染HT29细胞,培养阳性单克隆细胞株;MTT法检测Rap1GAP对细胞增殖的影响;流式细胞术检测Rap1GAP对细胞周期和凋亡的影响;Transwell实验检测Rap1GAP对细胞侵袭和迁移的影响;Western blot检测FAK、pFAK、ERK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白表达;Western blot 检测 FAK 抑制剂 Y15 和 EPAC2 激活剂 8-CPT-2’-O-Me-cAMP 干预 HCT116 后 Rap 活性和 FAK、ERK 等蛋白;Western blot检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaB、TSA,DNA甲基化抑制剂5-Aza干预结肠癌细胞后Rap活性和FAK、ERK等蛋白。结果:成功筛选出HCT116-pLVPT-Rap1GAP单克隆细胞和HT29-PX459-sg-Rap1GAP单克隆细胞。在HCT116-pLVPT-Rap1GAP细胞中,细胞的增殖能力受到明显抑制(P<0.05),在HT29-PX459-sg-Rap1GAP细胞中,细胞的增殖能力明显增强(P<0.05);在 HCT116-pLVPT-Rap1GAP 细胞中,G0/G1 期细胞增多(P<0.05),在 HT29-PX459-sg-Rap1GAP 细胞中,G0/G1 期细胞减少(P<0.05);在 HCT116-pLVPT-Rap1GAP 细胞中,细胞的侵袭和迁移能力受到明显抑制(P<0.05),在HT29-PX459-sg-Rap1GAP细胞中,细胞的侵袭和迁移能力明显增强(P<0.05);在HCT116-pLVPT-Rap1GAP细胞中,FAK、ERK 不变 pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白下调(P<0.05),在HT29-PX459-sg-Rap1GAP 细胞中,FAK、ERK 不变,pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白上调(P<0.05);8-CPT-2’-O-Me-cAMP 作用后,HCT116 细胞中 Rap2-GTP增加,pFAK、pERK、Cyclin D1、Cyclin E、MMP9、MMP2 上调(P<0.05),FAK 阻断剂Y15完全抑制这种作用。在HCT116和DLD1细胞中,NaB使Rap1GAP上调,Rap2、FAK、ERK 不变,Rap2-GTP、pFAK、pERK 下调(P<0.05);TSA 也能使 Rap1GAP 上调(P<0.05),5-Aza则无明显作用。在HT29细胞中,用NaB、TSA和5-Aza处理对Rap1GAP表达没有影响。结论:Rap1GAP抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭、迁移,机制可能与Rap1GAP抑制FAK/ERK活化有关。结肠癌细胞HCT116和DLD1中Rap1GAP的表达受乙酰化调节,并且与调节Rap2的活性和ERK/FAK的磷酸化有关。第四部分淫羊藿苷通过Rap 1 GAP介导的FAK/ERK通路抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移目的:研究淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭、迁移的影响,并探讨其作用机制是否与调控Rap1GAP介导的FAK/ERK通路有关。方法:不同浓度的淫羊藿苷(5、10、15、20、25μmol/L)作用于对数生长期的HCT116细胞,采用MTT法检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116的增殖影响;通过Transwell侵袭实验和迁移实验比较淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116侵袭和迁移影响;流式细胞技术检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116凋亡和周期的影响;qRT-PCR检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116中Rap1GAP的mRNA的影响;Western blot方法检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116 中 Rap1GAP、FAK、pFAK、ERK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2蛋白表达的影响。结果:不同浓度的淫羊藿苷对HCT116细胞的增殖能力有明显抑制作用(P<0.05),一定范围内具有时间剂量依赖性,作用于HCT116细胞24h,48g,72h的半数抑制浓度(IC50)为21.04μmol/L,18.80μmol/L,17.26μmol/L;淫羊藿苷对HCT116细胞的侵袭和迁移能力有明显抑制作用(P<0.05),并且呈浓度依赖性;淫羊藿苷能够诱导HCT116细胞发生凋亡(P<0.05),并且呈浓度依赖性;淫羊藿苷作用后G0/G1期的HCT116细胞百分比升高(P<0.05),并且呈浓度依赖性;HCT116细胞中Rap1GAP的mRNA和蛋白质水平上调,FAK、ERK 蛋白不变,pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白水平下调(P<0.05)。结论:淫羊藿苷能够抑制结肠癌细胞HCT116的增殖和侵袭能力,其机制可能与作用Rap1GAP调控FAK/ERK通路有关。本研究利用qRT-PCR检测首次发现Rap1GAP在正常-腺瘤-癌这一疾病的动态发展过程中越来越低,而且其表达与恶性程度更高的分型分期分级呈负相关,然而三种甘丙肽受体(GALR1、GALR2、GALR3)在不同组织和粪便中并没有显著差异;通过建立裸鼠结肠癌皮下移植瘤和小鼠结肠癌肝转移瘤膜型,首次发现淫羊藿苷在体内对结肠癌生长和转移具有抑制作用,并且可能与干预Rap1GAP和FAK/ERK活性有关;此外,在结肠癌细胞中发现Rap1GAP能够通过干预FAK/ERK信号通路调节细胞的增殖和迁移,并且发现在结肠癌细胞HCT116和DLD1中Rap1GAP通过乙酰化修饰调控Rap2的活性;最后,在体外实验证明了淫羊藿苷能够抑制结肠癌细胞增殖和迁移,并且与Rap1GAP调控FAK/ERK活性有关。这些结果初步明确了淫羊藿苷抑制结肠癌的一部分作用靶点,丰富了中医补肾法治疗肠癌的法则,为中药淫羊藿的药理研究和临床治疗提供了一定的理论基础。