【摘 要】
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目的 邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是常见的增塑剂之一,广泛分布于环境中,属于环境内分泌干扰物,具有明显的生殖毒性.本文应用分子克隆技术,构建类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenio acute regulatory protein,StAR)基因高表达载体,建立StAR基因高表达细胞株,检测邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯
【机 构】
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深圳市疾病预防控制中心毒理研究所 深圳大学生命与海洋科学学院在读硕士研究生
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目的 邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是常见的增塑剂之一,广泛分布于环境中,属于环境内分泌干扰物,具有明显的生殖毒性.本文应用分子克隆技术,构建类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenio acute regulatory protein,StAR)基因高表达载体,建立StAR基因高表达细胞株,检测邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)对细胞凋亡基因的影响.方法 PCR扩增StAR基因并将其克隆到慢病毒高表达载体中,将已经构建的慢病毒载体进行转染,收集病毒上清,感染MCF-7乳腺癌细胞,用嘌呤霉素进行筛选得到StAR基因高表达细胞株,通过基因测序、荧光定量PCR和western blot鉴定细胞株.用DEHP 0,0.05,0.10,0.20,0.40和0.80 mmol/L对正常MCF-7细胞和StAR基因高表达细胞进行染毒24h,实时定量PCR检测凋亡基因bax,caspase-3,caspase-8的基因表达与蛋白质表达变化.结果 测序证明重组慢病毒高表达载体StAR基因序列正确,荧光定量PCR检测StAR基因高表达细胞株比正常MCF-7细胞StAR基因表达升高591.9倍.Western blot结果显示,StAR基因高表达细胞株StAR蛋白表达水平比正常MCF-7细胞190％.StAR基因高表达细胞bax,caspase-3,caspase-8 mRNA表达水平随DEHP浓度增加呈上升趋势,DEHP染毒24 h,StAR高表达细胞的凋亡基因Bax表达水平明显高于对照组,从低剂量组至高剂量组分别升高20％～100％,凋亡基因caspase-3表达水平从低剂量组至高剂量组分别升高30％～700％,caspase-8表达水平明显高于对照组,从低剂量组至高剂量组分别升高到对照组的10％～760％.结论 DEHP对StAR基因高表达细胞中的凋亡基因表达具有明显促进作用,说明StAR基因是参与调控DEHP内分泌干扰作用的重要因素,与DEHP毒性存在明显关系.
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