噪声性耳聋是一种常见的感音性耳聋,其发病原因除了噪声导致的机械损伤,还引起了包括代谢损伤在内的一系列器官、细胞及分子水平的病理变化。血管纹位于耳蜗外侧壁的螺旋韧带内侧,血管纹微血管是血-迷路屏障(blood-labyrinth barrier,BLB)的主要构成部分,BLB是位于血管纹中间层的一层特殊分化的毛细血管网,通过紧密连接和膜屏障调控耳蜗内微环境,对维持耳蜗内电位稳定至关重要。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),具有高度生物活性的血管通透因子,噪声暴露后VEGF在血管纹的表达明显增高,影响血管纹微血管通透性,此外,血管纹微血管内皮细胞间的黏附连接在调节微血管通透性方面也起着重要作用,并且连接蛋白的表达及功能受VEGF调控。在VEGF对钙黏连蛋白(VE-cadherin)的调节过程中,酪氨酸激酶(Src kinase)起到至关重要的作用。血管纹损伤引起的微血管通透性增高、血迷路屏障破坏,是导致噪声性聋的原因之一。但噪声对血管纹微血管的损伤机制仍不明确,VEGF如何调控微血管通透性仍需要深入研究。同位素标记的相对和绝对定量法(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术是一种利用同位素标记蛋白质和多肽的技术。结合液相色谱分离联合质谱鉴定技术,可以标记生物蛋白样品中的几乎所有肽段。iTRAQ技术能够发现非生理状态下的疾病特异性蛋白,有利于阐明疾病发病机理以及疾病的预防、诊断、治疗及预后监测。iTRAQ等体外标记定量技术可以高效的应用于差异蛋白的筛选,但最终筛选的蛋白质是否有意义,需要进行后期验证。平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)是靶向蛋白质组学的一种技术,应用于检测目标蛋白质,是目前最灵敏的质谱检测技术,作为蛋白质谱分析的“金标准”,被越来越多的应用于差异蛋白后续验证,具有高通量、特异性和高灵敏度等优点。蛋白质组学技术的发展,有助于我们明确噪声损伤后耳蜗血管纹的蛋白质水平变化,为噪声性聋的防治提供新方向。第一部分:为研究噪声对耳蜗血管纹微血管的损伤,及VEGF对微血管通透性的调控机制,本部分实验应用噪声性聋小鼠模型,采用免疫荧光法、免疫印迹实验和激光共聚焦显微镜成像扫描技术观察噪声暴露后耳蜗血管纹VEGF、Src的表达变化及微血管通透性的改变。通过腹腔注射血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂SU5416和Src抑制剂PP1,比较噪声暴露后血管纹微血管内皮细胞间VE-cadherin表达量的变化,通过尾静脉注射Evansblue,观察微血管通透性的改变。发现:噪声暴露后小鼠耳蜗血管纹血管内皮细胞中VEGF和边缘细胞中Src表达量增多,而内皮细胞间VE-cadherin表达量降低,微血管通透性增高;应用VEGFR2抑制剂SU5416后,SU5416组Src表达量较NE组显著降低,而VE-cadherin表达量较NE组显著增多;应用Src抑制剂PP1后,PP1组VE-cadherin表达量较NE组显著增多,且血管纹微血管通透性较NE组降低。提示噪声引起的血管纹微血管通透性增高受VEGF调控,VEGF通过与VEGFR2结合后激活Src来调控内皮细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin的表达,是噪声暴露后血-迷路屏障通透性增加的重要原因。第二部分:为探讨噪声损伤后耳蜗血管纹的蛋白质水平变化,本部分实验进行了耳蜗血管纹蛋白质组学研究。应用iTRAQ技术对噪声暴露前后小鼠耳蜗血管纹的差异蛋白进行筛选,并应用生物信息学分析对差异蛋白进行GO(Gene Ontology)分析和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析。结果显示:iTRAQ 技术共鉴定到2852个蛋白,噪声暴露后表达差异蛋白171个,其中上调56个,下调115个。上调蛋白中,表达量较高的蛋白包括角蛋白Ⅱ型细胞骨架8(Krt8)、波形蛋白(Vim)、角蛋白Ⅰ型细胞骨架18(Krt18)、角蛋白Ⅱ型细胞骨架7(Krt7);下调蛋白中,表达量较高的蛋白包括Kcnj10蛋白(Kcnj10)、缝隙连接蛋白beta-2(Gjb2)、神经细胞黏附分子1(Ncam1)、谷氨酰氨合成酶(Glul)、缝隙连接蛋白beta-6(Gjb6)、载脂蛋白D(Apod),表达差异倍数大于1.5倍的蛋白包括Kcnj10蛋白(Kcnj10)、泛素羧基末端水解酶14(Usp14)、神经细胞黏附分子1(Ncam1)、缝隙连接蛋白beta-6(Gjb6),其中与K+转运相关的蛋白包括:Kcnj10蛋白(Kcnj10)、内向整流钾通道13(Kcnj13)、溶质载体家族12(Slc12a9);GO分析显示上调蛋白主要参与免疫反应、氧化磷酸化,提示噪声导致血管纹细胞代谢反应增高,下调蛋白主要是离子转运相关蛋白,与噪声破坏血管纹的K+循环相关;KEGG分析差异蛋白显著富集的通路包括脂类分解、朊病毒病、MAPK信号通路、EB病毒感染、氮代谢信号通路,这些信号通路在炎症、免疫反应和细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用,可能参与了噪声导致的血管纹损伤机制。第三部分:为了进一步明确噪声损伤后耳蜗血管纹蛋白质组学差异蛋白的意义,本部分实验应用PRM技术对第二部分中iTRAQ筛选出的差异蛋白进行定量验证,运用生物信息学方法分析噪声对耳蜗血管纹损伤的机制。结果显示:经PRM验证与iTRAQ定量结果一致的9个蛋白中,上调蛋白包括富含组氨酸糖蛋白(Hrg)、cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基(Prkaca)、角蛋白,Ⅰ型细胞骨架18(Krt18)、四次跨膜蛋白(Cd63)和细胞粘附分子4(Cadm4);下调蛋白包括载脂蛋白D(Apod)、肌醇质子转运蛋白(Slc2a13)、Kcnj10蛋白(Kcnj10)和Myo1b蛋白(Myo1b)。GO分析其生物过程主要涉及细胞黏附连接、细胞凋亡、蛋白磷酸化、氧化应激、炎症因子反应及K+转运,提示噪声对血管纹的损伤涉及细胞间连接损伤、K+循环破坏及多种复杂代谢机制。蛋白互作分析发现差异蛋白主要涉及VEGF-VEGFR2信号通路、黏着斑信号通路和MAPK信号通路。综上,噪声暴露对耳蜗血管纹蛋白质水平的影响,主要表现为免疫反应和氧化磷酸化等代谢反应增高,对钾离子和微循环平衡的调节有重要作用的离子转运相关蛋白和钾离子通道下调。噪声介导的K+循环障碍、连接蛋白破坏、细胞凋亡、氧化应激反应及蛋白磷酸化是造成血管纹损伤的主要机制。VEGF-VEGFR2信号通路是噪声暴露后耳蜗血管纹微血管通透性改变的重要机制,VEGF通过与VEGFR2结合后激活Src来调控内皮细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin的表达,黏着斑信号通路和MAPK信号通路在噪声对血管纹的损伤中也起到重要作用。