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<正>RNA干扰又称RNA干涉(RNA interference,RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA) 介导的细胞内mRNA发生特异性降解,导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失。RNAi 技术作为基因沉默的有力工具,在医药研究与开发、基因治疗和功能基因组研究等方面的应用得到飞速发展。我们分析烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)基因序列,根据siRNA(short interfering RNA)设计原则,选定出一个可形成siRNA的cDNA(通常21nt)密集区域。区域中含有3条cDNA 链,并设计编码产生小分子发卡RNA(hairpin RNA,hpRNA)的DNA序列,将其连接到农杆菌双元载体质粒上,构建植物表达载体。编码hpRNA的DNA各链反向互补,中间加上7个碱基的间隙,两端加上符合本实验室现有载体p2355的酶切位点XbaI和BamHI,据此合成相应的编码DNA(dsDNA) 片段。片段长度为55bp,分别命名为TMVsil、TMV si2、TMVsi3。中间载体p2355,长度12578bp, 是农杆菌双元载体质粒,具细菌卡那霉素抗性,由本实验室构建。该质粒携选择基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)和1个CaMV35S启动子及Nos终止子单元,此单元的启动子和终止子之间是多克隆位点区,外源片段即插入此区域。分别合成TMVsil、 TMV si2、TMVsi3反义链和正义链,复性后插入连接到p2355上。连接产物转化大肠杆菌并筛选重组子。据上游CaMV35S启动子和下游Nos终止子序列设计引物,PCR扩增重组质粒,回收产物克隆到T-vector上进行测序分析,结果表明合成片段成功插入到中间载体中且序列正确。siRNA,只要(除中间的间隔序列外)出现一个碱基的差异,都会影响后续RNA的干扰作用,因此测序验证克隆到载体中目的片段的准确性十分必要。结果表明我们已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体。进一步将通过农杆菌介导,导入烟草细胞基因组中,获得转基因植株,其外源编码DNA转录产物可能形成hpRNA,产生小分子dsRNA(21 nt),具有潜在诱导RNA干扰的能力,以期获得抗病毒病的新材料,为植物抗病毒研究提供新途径。