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人肝微粒体中药物代谢酶是参与药物代谢过程的主要酶类,不管是合成药物,还是组成复杂的中药,主要是经过肝脏中药物代谢酶的代谢转化成易于排泄的化合物.药物代谢酶因基因多态性导致个体差异性表达,因此,对药物代谢酶的含量进行准确定量对药物的药理、药物相互作用和临床应用具有重要意义.高效液相色谱-质谱方法是一种用于生物样本中蛋白质绝对定量的常用技术,因其高灵敏度、高选择性和高通量的特点,加之不需要特异性的抗体,已经成为药物代谢酶定量分析的常用方法[1,2],但由于定量药物代谢酶时内标制备基体干扰及单点校正等问题,影响了该方法的准确度和规模化应用,为此,我们建立了一种18O/金属等重标记结合串联质谱蛋目标白质组绝对定量新方法1,2:通过金属标记肽段N-末端、18O标记肽段C-端实现双重等重标记,使内标肽段与目标肽段在一级质谱分析时质荷比相同,而在串联质谱分析时达到同时分离和碎裂,并可基于内标肽段与目标肽段产生的相同质谱相应,但不同质荷比的b、y离子进行定量.实验结果表明选择18O+Ho与Tm重等重标记都能对肽段实现高效标记并且7天内保持稳定,满足标记定量要求;两种标记肽段在色谱中保留时间完全一致,保证了在质谱碰撞池中同时碎裂;18O+Ho与Tm标记肽段等量混合后,经二级质谱分析碎裂后的b、y离子以相差4 Da和1:1信号强度比在质谱谱图中成对出现,说明定量的准确性高;最后选择腾冲嗜热菌全蛋白酶切肽段作为基质,采用多反应监测质谱分析目标肽段的b和y离子,其母子离子对在两个数量级范围内R2均为0.999,定量限达到0.7 fmol/μL且RSD<10%,相对误差小于10%,表明该方法可以准确地用于目标蛋白质组的绝对定量分析.另外,我们还提出了一种新的计算方法计算标准样本中内源分析物的浓度,即以内标分析物浓度为横坐标,以内标(重标)和内源分析物(轻标)的质谱峰峰面积比(重标:轻标)为纵坐标建立线性回归方程,准确求出了内源分析物的浓度.然后以稳定同位素标记肽段与内源性肽段的浓度比为横坐标,以他们的峰面积比为纵坐标,建立标准曲线,每个肽段的每个定量子离子的峰面积比带入标准曲线,可以获得对应的浓度比来计算待测样本中内源性肽段的浓度.通过方法学评价,所建方法的准确度97%,检测限LOD为3 fmol,定量限LOQ为低于20 fmol,5次测量的变异系数低于10%,线性范围为低于20 fmol-1000 fmol,与一般常用的工作曲线法计算法相比,可提高定量结果的准确性.进一步将此以上所建方法用于人肝微粒体样本中的药物代谢酶含量的测定,测定结果与文献报道结果一致,表明所建方法可以可靠用于生物样本中目标蛋白质组的含量测定.