论文部分内容阅读
[目的]建立高表达GDF5基因脂肪间充质干细胞稳转细胞株,植入大鼠尾椎间盘,修复椎间盘退变。[方法]大鼠脂肪间充质干细胞(ASC)由携带GDF5慢病毒载体采用不同转染复数(M0I:1,5,10,20,40,60,80,100)转染,48小时候荧光显微镜和流式细胞仪评估转染效率,选择最佳转染条件。CCK8法评估转染后细胞增殖,Real-timePCR、Western Blot及Elisa检测转染后GDF5基因及蛋白表达。培养7天后,Real-time PCR、Western Blot及免疫细胞荧光检测转染GDF5-ASC中Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因和蛋白水平的变化,评估高表达GDF5-ASC体外分化为类髓核细胞的表征。针刺法建立大鼠尾椎椎间盘退变模型,同时植入GDF5-ASC。分组如下:1)阴性对照组:针刺椎间盘后注射2μl PBS;2)正常对照组:仅针刺至皮下,椎间盘不做干预;3)处理组:针刺椎间盘后注射5×104/2μl GDF5-ASC或ASC。分别于处理后1月、2月、3月拍摄X线片,评估各组椎间隙指数变化;HE染色、甲苯胺蓝、Safranin O-Fast green染色及免疫组化评估不同组在各个时间点组织学情况。[结果]携GDF5基因慢病毒转染ASC最佳MOI为160,48小时后转染效率达88%。CCK8结果表明MOI为160时前3天细胞增殖较为转染组降低(P<0.05),第4天两者增殖无统计学差异(P>0.05)。Real-time PCR、Western Blot及Elisa检测结果显示GDF5-ASC细胞基因空载组(eGFP-ASC)及未转染组相比,GDF5在基因、蛋白水平显著上调(P<0.05)。培养7天后Real-time PCR、Western Blot检测GDF5-ASC中Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因和蛋白水平也较基因空载组(eGFP-ASC)及未转染组显著升高(P<0.05),免疫细胞荧光检测显示Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan成阳性表达。细胞植入大鼠针刺椎间盘退变模型后,GDF5-ASC组在3个月内观察期间椎间隙指数、基因表达水平及组织学评分情况均优于PBS组和ASC组(P<0.05)。[结论]慢病毒可成功介导GDF5基因高效稳定转染大鼠ASC,体外可诱导ASC向髓核样细胞分化,体内植入大鼠椎间盘退变模型后可有效修复椎间盘退变。GDF5-ASC结合了基因治疗和种子细胞,有望成为治疗椎间盘退变的理想方法。