【摘 要】
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CRISPR/Cas9系统是用于包括家畜在内的各种生物中进行基因组编辑的简单且强大的工具。然而,由于难以操作禽类的受精卵,该系统应用于家禽的报道甚少。本文报告了CRISPR/Cas9介
【基金项目】
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广西自然科学基金(2018GXNSFDA281026);国家自然科学基金(31660653);广西科技计划重点研发项目(桂科AB16380098)
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CRISPR/Cas9系统是用于包括家畜在内的各种生物中进行基因组编辑的简单且强大的工具。然而,由于难以操作禽类的受精卵,该系统应用于家禽的报道甚少。本文报告了CRISPR/Cas9介导的单链退火(Single strand annealing,SSA)修复途径打靶鸡清蛋白(chicken ovalbumin,cOVA)基因的效果。在HEK293细胞系中共转染EGFP-SSA报告载体和Cas9/sgRNA表达载体质粒,CRISPR/Cas9系统中的sgRNA指导下,Cas9核酸酶发挥切割作用,使含cOVA基因组靶序列的报告载体引入形成双键断裂(Double strand breaks,DSBs),激活细胞内的SSA修复机制,实现EGFP基因阅读框的修复和绿色荧光蛋白的正常表达,最后进行流式细胞仪分析计算双荧光相对阳性细胞率,将其作为判断sgRNA活性的指标。结果显示所检测的6个打靶核酸酶活性分别为12.7%,18.4%,13.1%,14.7%,23.7%,22.4%,证明了CRISPR/Cas9系统对进行鸡基因打靶的可行性,证实单链退火是检测核酸酶活性的有效方法。
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