【摘 要】
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肌红蛋白(myoglobin,Myo)作为肌细胞损伤后较敏感的检测标志物被广泛应用于临床研究。为得到大量高纯度的Myo,本研究利用两步法合成人肌红蛋白全基因的基础上,构建原核表达载
【机 构】
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东北林业大学生命科学学院; 上海麦柏星生物科技有限公司;
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肌红蛋白(myoglobin,Myo)作为肌细胞损伤后较敏感的检测标志物被广泛应用于临床研究。为得到大量高纯度的Myo,本研究利用两步法合成人肌红蛋白全基因的基础上,构建原核表达载体并通过BL21(DE3)表达其融合蛋白;将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化。其结果:1)Myo全基因合成:在NCBI查询得到Myo氨基酸序列,并将Myo密码子经过优化得到大肠杆菌惯用的密码子,反转录后得到Myo全序列,并利用两步法合成Myo全基因;2)表达载体构建:将Myo片段并与pMD18-T Simple载体相连,得到重组质粒Myo-pMD18-T Simple。利用Myo-pMD18-T Simple上特异性酶切位点,将Myo片段进行酶切胶回收,并与原核表达载体pET-28a连接,获得可用于原核表达的重组质粒Myo-pET-28a;3)重组蛋白的表达和纯化:利用Myo-pET-28a转化表达型感受态细胞BL21(DE3),获得表达菌株,并对表达条件进行优化。在最佳诱导温度、时间、浓度下进行IPTG诱导表达,最终得到Myo-His融合蛋白。利用镍柱对Myo-His融合蛋白进行纯化,经透析浓缩得到纯化蛋白。本研究获得的高纯度Myo为其单克隆抗体的筛选以及临床检测试剂盒的制备奠定了基础。
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