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微管相关蛋白1B(Microtubule associatedproteins;MAP1B)的生物学活性受其磷酸化修饰调节,蛋白磷酸酶2A(Protein Phosphotase 2A;PP2A)对MAP1B去磷酸化具有调控作用,但磷酸化修饰后MAP1B对骨髓间充质干细胞(Bone msenchymal stem cells;BMSCs)靶向损伤脊髓迁移的作用及BMSCs内调控MAP1B磷酸化修饰的机制尚未见相关报道.
目的:本论文旨在验证BMSCs内PP2A介导的Ⅰ型MAP1B磷酸化形式(Type I of phosphorylated MAP1B;P1-MAP1B)去磷酸化在脊髓缺血性损伤(Spinal Cord Ischemia Injury;SCII) BMSCs靶向脊髓迁徙中的作用,及BMSCs内调控MAP1B磷酸化修饰分子机制.
方法:1、兔BMSCs体外培养、鉴定。2、应用CM-Dil对BMSCs进行体外荧光标记和体内示踪.3、PP2A抑制剂OA和激动剂C2-ceramide预处理BMSCs;通过同位素32P标记蛋白底物法和Westem-blot分别检测删活性与Ⅰ型MAP1B磷酸化形式P1-MAP1B含量。3、应用节段性腰动脉阻断术建立兔SCII模型,随机分为四组:IG组(抑制剂组)、AG组(激动剂组)、UG组(未治疗组)和CG组(对照组);经耳缘静脉移植BMSCs后观察各组BMSCs活体内靶向脊髓迁移情况。4、应用磷酸化抑制剂LY294002与U0126分别阻断BMSCs内的P13K和ERK1/2通路,Western-blot定量检测BMSCs内P1-MAP1B.
结果:1、所收获BMSCs形态典型,具有间充质干细胞生长特性;2、CM-Dil荧光标记BMSCs后标记率达到99%以上;OA与C2-ceramide处理细胞后PP2A活性分别降低61%和增长78%(P<0.05),P1-MAP1B表达分别增高和降低(P<0.01),而MAP1B表达无明显变化(P>0.05).干预效果可维持48h.OA与C2-ceramide预处理细胞后测得生长曲线较低平,BMSCs增殖略减缓(P<0.05);3、成功建立兔脊髓缺血性损伤模型并移植BMSCs后,在激光共聚焦显微镜下观察可见:移植2天后,IG组和AG组在脊髓损伤部位均未发现荧光标记BMSCs聚集,UG组相应部位可见少量散在BMSCs;移植4天后IG组和AG组的脊髓损伤部位可见BMSCs聚集;4、与对照组相比较,抑制P13K活性后MAP1B磷酸化水平升高;而抑制ERK1/2后MAP1B磷酸化水平降低(P<0.05).
结论:证明BMSCs内PP2A介导的MAP1B去磷酸化在调节BMSCs靶向脊髓损伤迁移过程中发挥重要作用。其中作用机制可能是MAP1B与P1-MAP1B维持动态平衡参与调节BMSCs靶向迁移,为MAP1B蛋白功能研究提供新的理论依据.目前尚无关于MAP1B与BMSCs靶向脊髓损伤迁移之间关系的报道.
目的:本论文旨在验证BMSCs内PP2A介导的Ⅰ型MAP1B磷酸化形式(Type I of phosphorylated MAP1B;P1-MAP1B)去磷酸化在脊髓缺血性损伤(Spinal Cord Ischemia Injury;SCII) BMSCs靶向脊髓迁徙中的作用,及BMSCs内调控MAP1B磷酸化修饰分子机制.
方法:1、兔BMSCs体外培养、鉴定。2、应用CM-Dil对BMSCs进行体外荧光标记和体内示踪.3、PP2A抑制剂OA和激动剂C2-ceramide预处理BMSCs;通过同位素32P标记蛋白底物法和Westem-blot分别检测删活性与Ⅰ型MAP1B磷酸化形式P1-MAP1B含量。3、应用节段性腰动脉阻断术建立兔SCII模型,随机分为四组:IG组(抑制剂组)、AG组(激动剂组)、UG组(未治疗组)和CG组(对照组);经耳缘静脉移植BMSCs后观察各组BMSCs活体内靶向脊髓迁移情况。4、应用磷酸化抑制剂LY294002与U0126分别阻断BMSCs内的P13K和ERK1/2通路,Western-blot定量检测BMSCs内P1-MAP1B.
结果:1、所收获BMSCs形态典型,具有间充质干细胞生长特性;2、CM-Dil荧光标记BMSCs后标记率达到99%以上;OA与C2-ceramide处理细胞后PP2A活性分别降低61%和增长78%(P<0.05),P1-MAP1B表达分别增高和降低(P<0.01),而MAP1B表达无明显变化(P>0.05).干预效果可维持48h.OA与C2-ceramide预处理细胞后测得生长曲线较低平,BMSCs增殖略减缓(P<0.05);3、成功建立兔脊髓缺血性损伤模型并移植BMSCs后,在激光共聚焦显微镜下观察可见:移植2天后,IG组和AG组在脊髓损伤部位均未发现荧光标记BMSCs聚集,UG组相应部位可见少量散在BMSCs;移植4天后IG组和AG组的脊髓损伤部位可见BMSCs聚集;4、与对照组相比较,抑制P13K活性后MAP1B磷酸化水平升高;而抑制ERK1/2后MAP1B磷酸化水平降低(P<0.05).
结论:证明BMSCs内PP2A介导的MAP1B去磷酸化在调节BMSCs靶向脊髓损伤迁移过程中发挥重要作用。其中作用机制可能是MAP1B与P1-MAP1B维持动态平衡参与调节BMSCs靶向迁移,为MAP1B蛋白功能研究提供新的理论依据.目前尚无关于MAP1B与BMSCs靶向脊髓损伤迁移之间关系的报道.